土壤细菌生物氧化Mn(Ⅱ)的分子机制研究

Although Mn(II)-oxidizing bacteria are found to be widely distributed naturally, little information is available on their metabolisms of biochemically oxidizing Mn(II) into Mn(III)/Mn(IV) oxides. In the current proposal, a naturally occurring soil-borne Escherichia coli with high Mn-oxidizing activity, MB266, was used as the target bacterium to probe and elucidate the molecular mechanism of manganese oxidization on the cell surface of this strain as well as the preliminary metabolic network. A transposition mutagenesis system will be initially performed to create the mutation library of MB266, which allows screening the mutants that were attenuated or fully losed the Mn(II)-oxidizing activities by using routine Mn-oxidization determinative assays. Subsequently, the anchor PCR and in situ hybridization technologies will be used to analyze the related effectors and their encoding genes from the MB266 genome, and the Real-time qPCR and proteomics technologies will be further employed to probe and confirm the functioning and regulative molecules involving in Mn(II) oxidization by comparatively investigating both MB266 and those negative mutant strains. Based on these results, the specific cell-surface display technology will be projected to immobilize the main Mn(II) oxidases including the common multicopper oxidase (MCO), onto the cell surface of E. coli recipient strains, aims at verifying the associated electron transfer proteins involving in Mn(II) oxidizing on the cell surface using Pull-down experiments, multiple analysis of the oxidization activities of different combinations of membrane components and oxidizing systems, as well as the gene corruption and complementation effect analyses towards those presumed electron transfer proteins. Thus, as a result of these approaches,the molecular mechanism and predicted metabolic network on the membrane of the target strain would be elucidated preliminarily.

以1株高锰氧化活性土壤大肠杆菌MB266为对象，拟研究其在细胞表面氧化Mn(Ⅱ)生成锰氧化物的分子机制及基本代谢网络。首先通过构建该菌株的转座突变文库，从中筛选导致锰氧化活性减弱与丧失的负变突变子，再利用锚定PCR和原位杂交技术确定其效应分子及编码基因；然后用Real-time qPCR和蛋白质组学技术，对比分析MB266菌株和负变菌株，确定直接参与锰氧化作用与起调控作用的蛋白质（酶）系分子。再利用细胞表面展示技术，以多铜氧化酶MCO等主要锰氧化酶为目标酶，通过Pull-down技术探究与MCO在细胞壁上发生耦联的电子传递蛋白，并通过体外纯化不同的细胞外膜组分和锰氧化蛋白组成多重体系，分析确定参与Mn(Ⅱ)细胞外膜电子传递体，结合构建基因中断突变株和进行质粒表达补偿作用，测定氧化Mn(Ⅱ)时与细胞膜电子传递体耦联的电子传递流向，来解析细菌MCO氧化Mn(Ⅱ)电子传递的反应体系与分子机制。

微生物被认为是自然界中氧化锰矿物形成的主要成因。虽然国内外对细菌氧化Mn(Ⅱ)的活性与产物属性开展了一定的研究，但是对细菌直接氧化Mn(Ⅱ)的分子机制的研究却很缺乏。本课题以 1 株高锰氧化活性土壤大肠杆菌 MB266 为对象，研究其在细胞表面氧化Mn(Ⅱ)生成锰氧化物的分子机制与基本代谢网络。首先通过构建该菌株的转座突变文库，从中筛选导致锰氧化活性减弱与丧失的负变突变子，再利用锚定PCR和原位杂交技术确定其效应分子及编码基因；然后用Real-time qPCR和蛋白质组学技术，对比分析MB266菌株和负变菌株，确定直接参与锰氧化作用与起调控作用的蛋白质（酶）系分子。通过对蛋白质组学中蛋白整体模块聚类分析，分别完成了锰氧化相关代谢网络的建立和信号转导系统机制的解析，揭示细菌可能间接作用于氧化锰的反应基因及细菌通过锰氧化过程从中获益的方式。发现与ROS应答相关的氧化还原酶类等蛋白发生显著上调，说明细菌锰氧化是一个复杂的多种因子共同参与作用的生物催化过程。利用细胞表面展示技术，以多铜氧化酶MCO等主要锰氧化酶为目标酶，通过体外纯化不同的细胞外膜组分和锰氧化蛋白组成多重体系，分析确定参与Mn(Ⅱ)细胞外膜电子传递体，结合构建基因中断突变株和进行质粒表达补偿作用，测定氧化Mn(Ⅱ)时与细胞膜电子传递体耦联的电子传递流向。证实了MCO表面展示重组菌在连续富Mn(II)培养下亦可形成聚集体，XPS实验显示聚集体主体为锰氧化物，且不同重组体形成的锰氧化物比例不同。在以上研究的基础上，提出了在大肠杆菌细胞表面由多铜氧化酶介导的Mn(II)氧化作用可能的分子机制。在基于多铜氧化酶及生物锰氧化物的应用上，分别构建了酚类检测生物传感器系统和毒死蜱、典型喹酮类药物环丙沙星、红霉素和内分泌干扰物等有毒物质的降解系统。在材料领域中，合成了新型生物源锂离子电池负极材料和壳聚糖与表面展示漆酶细胞的共价交联复合生物材料。

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