基于脱细胞生物支架的小脑再生的体外预血管化实验研究

Development of bio-artificial cerebellum is very important for expansion of cerebellar diseases treatment and central nervous system regeneration research. We have made certain achievements in our previous studies of the cerebellum regeneration, but due to lack of microvascular structure, the size of in vitro bio-artificial brain tissue and the complete process of blood vessels after transplantation into the brain are limited. Prevascularization co-culture system can be implemented in artificial microvascular formation of tissue before transplantation, is expected to become an important way to break through the bottleneck. Based on the early development of decellularized cerebellum scaffolds, this study proposes neural stem cells (NSCs) and vascular endothelial progenitor cells (EPCs) as the main body of the 3D spherical co-culture system, makes the realization of prevascularized cerebellum tissue in vitro, optimizes technical parameters and explores factors that influence efficiency of prevascularization. Evaluation of in vivo angiogenesis and neural axon regeneration after transplantation. Quantitative analysis of the density of regenerative blood vessels and blood perfusion. Through the determination of key regulatory factors preliminarily explore the potential molecular mechanism. This study contributes to the establishment of an in vitro prevascularization co-culture system for efficient reproduction of cerebellum, and realization of early construction of human brain tissue, which is expected to be a certain foundation for the reconstruction of brain function.

小脑再生研究对于小脑疾病治疗方案的拓展以及中枢神经系统的修复重建都具有非常重要的意义。在我们前期的研究中已经取得了一定的成果，然而生物人工脑组织因缺乏微血管结构，限制了其体外再生的规模和移植入脑内后的完整血管化进程。预血管化共培养体系可以实现人工脑组织体外微血管网络的形成，有望成为突破该瓶颈的重要途径。本课题拟以前期研制的小脑脱细胞支架为基础，构建以神经干细胞（NSCs）和血管内皮祖细胞（EPCs）为主体的3D球形共培养体系，在体外实现再生小脑组织的预血管化，优化技术参数并探讨影响预血管化效率的因素。进一步在体评价人工脑组织移植后的血管、神经再生情况，量化分析再生血管密度及血流灌注差异，进而通过关键调节因子的测定初步探究潜在分子机制。本研究有助于建立一个可以高效进行再生小脑组织体外预血管化的共培养体系，进而初步实现早期人工脑组织的构建，有望为脑功能的修复重建研究打下一定的基础。

由于中枢神经系统（central nervous system, CNS）内生能力有限且损伤后的环境不适宜细胞生长，传统治疗方法难以取得满意的治疗效果。过去的10余年间，基于细胞移植的治疗方法得到极大关注，然而单纯的细胞移植替代治疗目前尚没有取得令人满意的治疗效果。预血管化生物人工神经组织因其可以很好地弥补单纯细胞治疗的不足，已成为中枢神经再生医学新的研究热点。项目组将纤维多孔丝支架(FPSS)与adamts13转染的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外共培养，并将其移植到脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）小鼠模型中。在体外预血管化中，细胞呈管状结构，促进移植后血管的浸润和微血管网络的形成，并向病变部位募集神经细胞。行为分析显示，治疗组动物的运动功能明显改善。综上所述，研究结果表明FPSS-HUVEC系统促进了新生血管的形成，在损伤部位引导轴突生长，改善了微环境。预血管化策略为神经再生研究提供了一个新的方案。.外源性神经干细胞（Neural stem cell, NSCs）移植为脑损伤治疗开启了新的希望之门，但是如何在体外无创性示踪移植细胞的凋亡情况仍然是非常困难的。化学交换饱和转移（Chemical exchange saturation transfer, CEST）成像技术量化PH值的能力已经在既往研究中得到证实，而微环境的PH值与细胞存活状况密切相关。本研究利用DNA杂交技术将碘帕醇标记在NSCs细胞膜上，并移植到成体小鼠脑内。利用CEST-MRI检测并计算移植细胞所在微环境的PH值，间接评估移植的NSCs在体内的存活状况；同时，在脑损伤小鼠模型中移植Cy3标记的NSCs，观察移植细胞在脑损伤处的生存和分化能力，并检测NSCs在脑损伤区所发挥的功能作用。研究发现：1.基于碘帕醇的化学交换饱和转移效应，其可以作为示踪剂监测移植细胞周围微环境PH值状况，从而间接评估移植细胞的存活状态。2.移植的NSCs在体内生存分化，并且具有修复受损大脑的作用。3.DNA杂交技术为示踪干细胞在体内的命运提供了一个新的方法。.

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