紫斑牡丹PrMYB1转录因子调控花瓣基部色斑形成的分子机理

Spot at the base of petals of ornamental plants has high ornamental value, but few reports are involved in its regulatory mechanism. Paeonia rockii, the tree peony wild species with distinct black spot at the base of white petals, is considered as the main genetic origin of tree peony spot. In our previous study, a R2R3-MYB transcription factor, PrMYB1 has been shown as a candidate key gene for the spot formation by regulating the structural genes and then causing the abundant accumulation of cyanidin 3-glucoside at the base of the petals. In this study, spot and background of the petals of P. rocki will be collected at different stages when spot forms as materials. Firstly, the PrMYB1 genes will be cloned using RACE. Secondly, the key stages for spot formation will be identified through expression profiles analysis of PrMYB1 and anthocyanin biosynthetic structural genes using qRT-PCR and in-situ hybridization. Thirdly, the regulation pattern of the PrMYB1 will be identified by genome walking, yeast one-hybrid system and dual luciferase experiments; meanwhile, yeast two-hybrid system and bimolecular flurescence complementation experiment will be used to screen and verify the interactive proteins with PrMYB1. Finally, function of the PrMYB1 on the spot formation in P. rockii will be performed by down-regulating and up-regulating the PrMYB1 in P. rockii petals, and up-regulating it in tobacco petals. This research aims to elucidate the regulatory mechanisms of the spot formation of P. rockii, provide specific gene resources and theoretical supports for molecular breeding of variegation cultivars in tree peony, and also provide a reference for the studies on the spot formation mechanism in other plants.

花瓣基部色斑具有极高的观赏价值，但其形成的调控机理研究较少。紫斑牡丹花瓣基部的紫黑色斑，是牡丹色斑的主要遗传来源。课题组经紫斑牡丹花瓣转录组和表达量分析，发现了R2R3-MYB转录因子PrMYB1在花瓣基部极显著高表达，且与矢车菊3-葡萄糖苷含量呈正相关，推测PrMYB1可能调控了花瓣基部色斑的形成。本研究以花瓣非斑部位为对照，克隆PrMYB1并分析基因特性及其时空表达模式，通过花色素合成结构基因的启动子顺式作用元件分析、酵母单杂交和双荧光素酶试验分析PrMYB1对花色素合成关键结构基因的调控，利用酵母双杂交和双分子荧光互补试验筛选PrMYB1的互作蛋白，明确PrMYB1对色斑形成的调控模式；在烟草稳定过表达、紫斑牡丹花瓣瞬时过表达和抑制表达阐明PrMYB1对色斑形成的转录调控功能，揭示紫斑牡丹花瓣基部色斑形成的分子机理，为牡丹彩斑品种分子育种提供特异基因资源和理论依据。

紫斑牡丹是牡丹组革质花盘亚组的野生种，以花瓣基部独特而规则的花色斑为典型形态特征，受到商业和研究领域的广泛关注。大量研究表明紫斑牡丹基部紫黑色斑是牡丹彩斑的主要遗传来源，但其关于斑色形成的调控机制依然不完善。本研究以紫斑牡丹斑和非斑部位，以及杨山牡丹为材料，通过切片观察、测定细胞液 pH 值和金属元素量化紫斑牡丹色斑的表型及理化性质，确定斑色形成过程中的差异因素；然后通过转录组分析预测紫斑牡丹色斑形成关键转录因子PrMYB1，通过表达模式分析结合类黄酮含量及其代谢途径中的结构基因变化趋势，以及利用酵母单杂和双荧光素酶明确PrMYB1的调控模式，最后通过过表达和病毒诱导基因沉默试验验证其在斑色形成过程中的作用。。结果如下：.1.表型和理化性质分析表明，紫斑牡丹斑色的形成主要是由于花青素中芍药素在细胞液泡中大量积累，产生红色和紫色的有色细胞，而槲皮素和木樨草素作为助色素，使细胞中的紫色和红色加深，这些有色细胞集中在花瓣基部的表皮和栅栏组织中，形成色斑。.2.克隆了PrMYB1全长序列，并明确其主要在细胞核中起作用，随着斑色的加深，PrMYB1在花瓣基部表达量呈上升趋势，与PrDFR和PrANS表达模式一致。而且通过原位杂交分析，表明PrMYB1在紫斑牡丹花瓣基部上表皮表达强烈。.3.PrDFR和PrANS的启动子中均含有MYB位点，经酵母单杂和双荧光素酶活性分析，表明PrMYB1能明显激活PrDFR启动子活性。进一步证明转录因子PrMYB1可能通过调控结构基因PrDFR的转录进而参与了紫斑牡丹基部色斑形成过程。.4.使用农杆菌介导叶盘法在烟草中过量表达PrMYB1基因后，实时荧光定量结果显示，在OE-PrMYB1的烟草花冠中，几乎所有花青苷代谢途径结构基因，尤其是NtDFR以及内源bHLH基因都上调表达；同时，在紫斑牡丹花瓣上进行瞬时沉默PrMYB1，花瓣基部色斑明显缩小且颜色减淡，Cy3G、Cy3G5G、Pn3G、Pn3G5G显著降低，并伴随着PrDFR1在色斑上显著下调。因此，PrMYB1可以调控PrDFR1 的表达水平，影响紫斑牡丹花斑的形成。

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