基于in vivo动力学分析的波动环境下黑曲霉产酶得率调控机制研究

Aspergillus niger is used as an important industrial working host for enzyme production as its highly efficient protein excretion capacity. But the scale up processes of enzyme production by A. niger always encounter reduced yields, which is the bottleneck in its industrialization process. The recently developed in vivo kinetics study of microbe is boosting, which is used for discovering the in vivo regulation mechanism of microorganism during industrial scale-up. In this proposal, the glucoamylase production by A. niger will be chosen as a model system, and the dynamic response characteristics of A. niger central metabolism under extracellular substrate stimulus will be studied, through “stimulus-response” experiment design, combining fast sampling and quenching technique, thoroughly intracellular metabolites extraction technique and high accuracy mass spectrum measurement based on IDMS. From aspects of supply of key amino acids, ATP and NADPH, and formation of byproducts - polyols and organic acids, combining with constructed in vivo kinetic model, the regulation mechanism of central metabolism on enzyme yield of A. niger will be investigated through experiment and simulation. The aim is trying to discover the bottleneck that leads to decreased enzyme yield during scale-up. The constructed model will provide theoretical prediction tool for strain improvement and bioreactor design and optimization, and also help for developing rational scale-up strategy of enzyme production by A. niger.

黑曲霉因其高效的蛋白分泌特性而被作为重要的工业酶制剂生产菌种。但黑曲霉产酶发酵过程放大往往面临产酶得率降低的难题，成为限制其产业化的重要瓶颈。近年来发展起来的in vivo动力学研究，正逐渐成为揭示放大过程胞内调节机制的研究热点。本项目拟以黑曲霉产糖化酶为模式体系，通过“刺激-响应”实验，结合快速取样淬灭技术、高效胞内代谢物抽提技术及基于同位素稀释质谱法的高精度胞内代谢物定量技术，研究黑曲霉中心代谢途径在经历外界底物浓度刺激下的动态响应特性。分别从蛋白合成的关键氨基酸前体供应、ATP与NADPH供应，多元醇与有机酸等副产物生成等角度，结合形成的黑曲霉中心代谢in vivo动力学模型，通过实验及数值模拟研究，探讨波动环境下黑曲霉中心代谢的动力学调控对产酶得率的影响机制。揭示导致黑曲霉产酶放大困难的关键瓶颈，为黑曲霉菌种改造和反应器设计与优化提供理论预测工具，指导黑曲酶产酶的高效放大。

黑曲霉因其高效的蛋白分泌特性而被作为重要的工业酶制剂生产菌种。但黑曲霉产酶发酵过程放大往往面临产酶得率降低的难题，成为限制其实现产业化的重要瓶颈。通过本项目的实施，获得以下技术上的突破：建立了用于快速取样的取样装置，可实现0.5s时间内取样10mL；形成了一套基于同位素稀释质谱法的精确检测胞内代谢物浓度的方法，可精确定量0.1μmol/gDW的胞内代谢物浓度；开发了高效获取U-13C标记的胞内代谢物标品的新方法，将代谢物样品检测的成本从200元降低到40元。.利用开发的技术实施了葡萄糖脉冲刺激-响应以及溶氧水平刺激-响应实验，获取了黑曲霉在外部波动环境下的胞内外代谢物的动态响应数据。通过对葡萄糖浓度单脉冲和周期性脉冲下黑曲霉胞内中心代谢途径的中间代谢物浓度动态变化规律的研究，获得以下重要结果：1）EMP途径中，FBP代谢节点之前代谢物对胞外葡萄糖浓度刺激呈明显的正相关特性，随胞外葡萄糖浓度的波动而波动，但FBP之后的代谢物未表现明显的正相关特性；2）PPP途径中的6PG及S7P与胞外糖浓度波动呈正相关，但表现出一定的延迟；3）TCA途径中的MAL与胞外糖浓度波动呈正相关，但表现出更大的延迟；此外进行了溶氧波动刺激-响应实验，获取了黑曲霉胞内代谢物浓度的动态数据，获得以下重要结果：1）氧周期性刺激形成的氧限制阶段中心代谢途径中间代谢物的浓度明显积累，而氧充足阶段却大量消耗；2）周期性的氧浓度波动会在蛋白前体供应上产生显著影响，对菌体蛋白与糖化酶的共性前体氨基酸（Ala、Gly与Leu）其逐渐上升，而菌体特异前体氨基酸（Glu、Lys）中Glu显著下调，糖化酶特异前体氨基酸（Ser、Thr）中Ser有明显上调，由此说明一定的DO限制有助于糖化酶的生成。.以上通过项目开发的实验技术可在其他菌种的代谢物组学及动力学研究中得到推广，得到的重要结论对于理解黑曲霉在环境波动中的代谢规律有了清晰认识，为其实现更高效的理性放大提供了重要的理论支撑。

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