利用RNAi工程微藻控制寨卡病毒、登革病毒传毒媒介伊蚊

The dengue fever is a strong infectious disease in southern China, and Southern China is also a potential area of Zika virus disease. Both diseases are transmitted by Aedes aegypti. The key to controlling the spread of these two diseases lies in controlling mosquitoes. However, insecticides have environmental pollution and resistance issues, and therefore require an environmentally safe mosquito control technology instead. Microalgae are the natural foods of Aedes, feeding Aedes can make the target gene dsRNA transfering into its body, and killing the mosquito. In this study, the RNAi vector of V-ATPA or CHSA genes of Aedes was generated and introduced into Chlamydomonas. The engineered algae strains were screened out, and a small scale environmental release test was then conducted. This study lays the foundation for the use of microalgae to prevent and control the transmission of mosquitoes.

我国南方地区是烈性传染病登革热高发区，同时也是寨卡病毒病潜在发病区，两病均由伊蚊传播。防控它们以控制蚊虫为主，但杀虫剂有环境污染和耐药性问题，因此需要一种环境安全的控蚊技术来替代。微藻是伊蚊的天然食物，饲喂伊蚊能使目标基因dsRNA进入其体内，杀死伊蚊。本研究拟构建伊蚊V-ATPA和CHSA基因RNAi载体，导入衣藻并喂食伊蚊，筛选出工程藻株，进行小规模环境投放。为利用微藻防控传病蚊虫打下基础。

生物杀蚊是一个世界性的课题和难题，因为蚊子是传播包括疟疾、黄热病、登革热、寨卡病、基肯孔雅病、流行性脑炎等世界范围内严重影响到公共安全的流行疾病的重要媒介。上述疾病每年造成大量人员死亡和经济财产的损失。目前控制蚊虫传播主要有以下几个方式：（1）物理杀蚊，如蚊帐，或通过减少积水死水。（2）杀虫剂：及时高效但杀虫剂有环境污染和耐药性问题，同时对非靶标生物也会造成伤害。（3）生物杀蚊：包含沃尔巴克氏体属细菌感染造成的后代不育技术，基于蚊虫本身的转基因技术，利用基因剪接雄性不育技术，基于蚊虫食物的转基因技术：利用苏云金杆菌毒蛋白的杀蚊技术；利用细菌、微藻、病毒为载体表达目标基因dsRNA，通过蚊虫口服，达到蚊虫致死效果。生物杀蚊属于对环境友好的控蚊技术。.本项研究构建了埃及伊蚊V-ATPA和CHSA基因的RNAi表达载体和叶绿体RNAi表达载体，并转化莱茵衣藻（小球藻），筛选获得多株检测阳性的重组藻株。随后，通过喂饲实验（10只和300只放大实验），验证了工程（重组）藻株使埃及（白纹）伊蚊致死，并阻滞伊蚊化蛹、羽化等。RT-qPCR检测显示伊蚊体内V-ATPA和CHSA基因的mRNA表达水平显著下降，RNAi达到预期目的。模拟现场试验中实验组CHSA工程藻株能有效降低伊蚊种群。模拟现场试验水体环境样品进行18S高通量测序分析后显示，CHSA工程藻株的快速繁殖，对水体中的浮游植物和浮游动物都有较大影响，初步推断由于营养竞争造成浮游植物和浮游动物属种数量的减少。.考虑到环境安全和生物安全的要求，我们对前期研究中对伊蚊幼虫致死作用较好的3HKT和HR3 RNAi 载体进行改造。通过Xhol 酶切，只回收含有3HKT/HR3 目标基因反向重复序列表达框架序列，转化衣藻，筛选得到无抗生素抗性标记基因的3HKT/HR3 RNAi转基因藻株。该转基因藻株经过10只伊蚊喂饲，300只放大试验和模拟现场试验，证明能够使伊蚊致死和控制伊蚊种群，具有商业应用前景。

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