棉铃虫病毒膜融合蛋白（F）的N-糖基化修饰及其功能研究

杆状病毒的膜融合蛋白（F）在病毒入侵和出芽过程中发挥关键作用。N-糖基化修饰对糖蛋白的结构及功能影响很大,但对于杆状病毒F蛋白的糖基化修饰缺乏深入研究。我们前期利用质谱技术鉴定出，在棉铃虫病毒HaF蛋白6个预测的N-糖基化位点中，有3个位点（N104,526,571）被修饰。此外，点突变分析提示还有2个位点（N293,361）可能被修饰。本研究拟进一步开展HaF关键N-糖基化位点的研究：通过点突变和组合突变，构建一系列含单、多点突变HaF基因的瞬时表达载体和重组杆状病毒；在此基础上，通过开展非还原Western blot、抗体中和、免疫荧光等，揭示N-糖基化修饰与F蛋白的构象及运输定位的关系；通过低pH诱导的膜融合、细胞和虫体水平的感染实验，分析糖基化对重组病毒感染性的影响。本项目预期将解析出棉铃虫病毒F蛋白N-糖基化修饰的关键位点及功能，为深入研究F蛋白在杆状病毒感染中的作用奠定基础。

本项目致力于鉴定棉铃虫病毒膜融合蛋白F（HaF）的N-糖基化位点、揭示糖基化修饰对F蛋白功能及病毒感染力的影响。我们紧密围绕研究计划，执行了各项研究内容，完成了预期目标。取得的重要研究进展包括：1）鉴定出HaF蛋白中存在5个N-糖基化位点，1个位于F2亚基，4个位于F1亚基。生物信息学预测HaF中有6个可能的N-糖基化位点。构建了糖基化位点单个突变的重组病毒；Western blot结果表明共有5个位点被糖基化，其中F2片段上有1个（N104），F1片段上有4个（N293、N361、N526和N571）。该结果也部分得到质谱数据的支持。2）揭示了糖基化修饰对F蛋白功能及病毒感染力非常重要，其中N526是最关键的1个。N526突变导致病毒感染力严重降低，而其他位点突变影响相对较小。除N526突变外，其他位点突变提高了F的融合能力，说明大部分糖基化修饰对于F的膜融合活性起阻碍作用。大部分糖基化位点突变削弱了F蛋白运输到细胞质膜的效率，其中N526突变后蛋白大量滞留在细胞质。脉冲追逐标记实验说明，N526突变导致F蛋白的折叠效率下降，在相同的表达时间仅有极少量蛋白折叠形成糖基化修饰的中间体。3）多个糖基化位点组合突变严重削弱F的功能和病毒毒力。构建了2、3、4和5个糖基化位点组合突变的一系列重组病毒，发现随着突变位点增加病毒感染力逐渐减弱，所有5个位点突变时，不能产生有感染力的病毒。进一步发现，多点突变严重影响蛋白的剪切、运输和膜融合活性。综上所述，N-糖基化修饰对于F蛋白的正确折叠、运输、膜融合活性和病毒感染力起到重要作用。其中，N526是最关键的1个位点，该位点的突变会导致F蛋白的一系列功能显著下调，同时降低重组病毒感染能力。上述结果促进了我们对于F蛋白在杆状病毒感染和致病中的作用的理解（已发表1篇国际会议论文，文章正在投稿中）。此外，还揭示了膜融合蛋白介导的病毒入侵和进化机制；鉴定出杆状病毒F蛋白亚单位间二硫键连接模式；解析了Beta属杆状病毒F蛋白和GP64之间的功能相关性；构建一株含有双价膜融合蛋白（F+GP64）、杀虫活性显著提高的重组病毒。共发表本项目标注的SCI文章4篇（1篇发表于Journal of Virology），国际会议论文1篇。申请人获2012年度中科院卢嘉锡青年人才奖。圆满完成了各项任务指标。

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