鳞翅目特异Osiris9基因的功能及应用研究

Drosophila Osiris genes are located in Tpl locus. The locus was found that was both haplo-lethal and triplo-lethal, and insecticide sensitivity, suggesting that Osiris genes could be served as new targets for pest controlling. Osiris is an insect-specific gene family and each member contains an evolutionary conservative DUF1676 domain. So far, the biological function of Osiris or DUF1676 domain is still unknown. This project intends to select Lepidoptera-specific Osiris9 genes from Lepidoptera economic insect Bombyx mori and pest Spodoptera litura. Transcripts and protein levels indicate the expression profiles and protein localization of Osiris9 genes. We plan to explore their functions of Osiris9 and its DUF1676 domain by recombinant expression, purification, Co-IP, binding of substrates, protein structure, etc. In vivo, the biological function of Osiris9 could be uncovered by RNAi; CRISPR/Cas9, and transgenic method. These results will provide theoretical value for exploring the biological function of insect Osiris genes, and provide new ideas and breakthroughs using its as new targets for pest control in agriculture and forestry.

果蝇Osiris基因簇位于Tpl基因座，该基因座位具有单倍体或三倍体致死效应和杀虫剂敏感性，可作为害虫生物防治的新靶标。Osiris为昆虫特有基因家族，含有一个保守的DUF1676结构域。但迄今为止，Osiris的生物学功能还未知。本项目拟选取鳞翅目特有的Osiris9基因，在鳞翅目经济昆虫家蚕和害虫斜纹夜蛾中开展研究，在转录和蛋白水平检测Osiris9的表达和定位；采用重组表达、分离纯化、Co-IP、结合底物、结构解析等方法研究Osiris9及其DUF1676结构域的功能；采用RNAi、CRISPR/Cas9和转基因等技术在个体水平研究Osiris9基因的生物学功能。该研究将为昆虫Osiris基因的生物学功能研究提供理论价值，也可作为遗传工程或新型生物杀虫剂的靶点，为农林害虫防治提供新的思路和突破口。

Osiris基因家族是昆虫特有基因家族，含有一个保守的DUF1676结构域。但迄今为止，Osiris的生物学功能还鲜有报道。本项目以鳞翅目经济昆虫家蚕和害虫斜纹夜蛾为模式，选取鳞翅目特异扩张的Osiris9基因，开展基因鉴定和进化分析、表达模式和定位、表达载体构建、转基因过表达、基因下调和敲除、蛋白相互作用等研究工作。进化分析发现Osiris9基因为鳞翅目特异扩张的亚家族，鳞翅目昆虫均含有6个串联拷贝，且物种间具有基因组共线性关系。表达谱分析发现鳞翅目特异的Osiris9基因成员主要在胚胎、幼虫丝腺、蛹期的表皮和翅原基表达。其中，家蚕的Osiris9a在家蚕丝腺特异表达，蛋白定位分析显示Osiris9a在中部丝腺合成，然后分泌到丝腺腔。免疫荧光结果显示Ser1与Osiris9a定位一致，利用Co-IP和质谱分析发现Ser1与Osiris9a相互作用。构建丝腺特异的转基因过表达载体，Osiris9a转基因系表达量显著提高。茧丝结构分析发现转基因蚕丝折叠结构和结晶度显著低于对照蚕丝。茧丝性能分析发现转基因茧丝在伸长率和韧度无明显变化，但强度显著降低，弹性模量显著增加。通过CRISPR/Cas9敲除Osiris9a基因，突变体蚕茧形状发生改变，产丝量减少，茧丝性能降低，表明Osiris9a在茧丝结构和性能上具有重要作用。昆虫Osiris基因可被微生物诱导表达，通过重组表达Osiris9蛋白，结果发现不同截短形式蛋白具有抑制细菌生长功能，其中，DUF结构域和跨膜结构域具有显著抑菌效果，表明Osiris基因具有抵抗微生物感染的功能。为了研究Osiris9基因在斜纹夜蛾翅膀发育中的功能，调查了斜纹夜蛾蛹期翅膀发育进程，Osiris9基因表达模式与翅膀翅脉形成一致。下调Osiris9基因，表型分析发现成虫翅膀发育畸形，翅脉内膜发育异常，暗示其在翅膀发育过程中扮演重要作用。综上所述，鳞翅目昆虫Osiris基因家族具有多重生物学功能，在家蚕茧丝结构形成、斜纹夜蛾翅膀发育和抵御微生物感染等方面扮演重要作用。因此，阐明鳞翅目昆虫Osiris基因的生物学功能，将为昆虫Osiris理论研究和害虫防控靶标应用研究奠定了基础。

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