嗜冷酵母对重金属胁迫的应答及金属硫蛋白的分离纯化和鉴定

重金属是环境的重要污染之一，对人类健康产生严重毒害。课题组前期研究发现极地嗜冷酵母能够耐受高浓度的重金属，诱导产生的重金属污染标志物- - 金属硫蛋白（Metallothionein，MT）能结合12个Cu离子/分子，远高于一般酵母MT的4个或8个，而且具有特殊的氨基酸组成，可能为一种新型MT。有关极地酵母对重金属的适应性及产MT的研究未见报道，本项目以嗜冷酵母为材料，开展以下工作：⑴分析嗜冷酵母对常见重金属离子的抗性，并进行菌株鉴定和系统发育分析；⑵从形态结构和生理生化变化（膜脂质过氧化及抗氧化系统等）分析重金属胁迫下酵母细胞的应答；⑶分离纯化酵母诱导的MT，并进行蛋白特性分析，拓展对MT遗传多样性的认知领域；⑷采用RACE和PCR技术，克隆MT基因，并进行生物信息学分析。本项目从形态结构、生理生化应答和分子水平（MT蛋白和基因）来揭示嗜冷酵母对重金属的适应机制，为重金属污染治理提供理依据。

重金属是环境的重要污染之一，对人类健康产生严重毒害。课题组利用巯基含量测定和离子色谱法，从160余种南极微生物中筛选出了一株高产金属硫蛋白的红酵母菌株AN5，经研究，该菌株对多种重金属具有较高的抗性，其中金属硫蛋白在重金属适应性方面起重要作用。本项目以南极适冷红酵母AN5为材料，分离纯化了金属硫蛋白，克隆了其基因，并从形态结构、生理生化应答和蛋白质及mRNA水平来揭示适冷酵母对重金属的适应机制，取得了以下研究成果：. （1）形态和分子生物学鉴定结果显示，高产金属硫蛋白的酵母菌AN5为Rhodotorula mucilaginosa；. （2）AN5经2 mM铜离子诱导，生长缓慢，由于氧自由基增多，细胞膜遭到一定的破坏，但SOD、POD、GR和CAT等抗氧化酶系统的活性升高，且类胡萝卜素和GSH等抗氧化剂含量增加，清除了细胞中产生的活性氧自由基。从形态和结构分析，铜离子诱导使菌体由椭球型变为近球形，体积减小，表面凹陷较深，但细胞超微结构基本无变化，保证了细胞的生长和繁殖；. （3）经过菌体培养、蛋白制备和凝胶层析分离，得到了纯化的金属硫蛋白，经蛋白特征测定和序列分析， MT蛋白中共有氨基酸残基106个，其中Cys 16个，存在4个C-X-C结构，能有效的结合重金属离子，部分揭示了金属硫蛋白的重金属结合特性。. （4）利用同源克隆技术，对酵母AN5中的MT基因进行了克隆并测序，测序结果与氨基酸序列分析完全一致，GenBank号为KJ866906。生物信息学分析表明，此基因开放阅读框为321 bp，编码106个氨基酸，分子量为10325.6，理论等电点为8.49，N端位置有一个典型的疏水性区域，不存在跨膜区，并模建出了其三级结构模型。. （5）通过2-DE和MALDI-TOF/TOF-MS相结合的技术，分析了铜离子诱导前后酵母菌中蛋白质的变化，鉴定出43种功能类型的不同蛋白，初步分析了这些差异蛋白与铜离子适应性的关系。. （6）利用建立的cDNA文库和高通量测序方法，分析了铜离子诱导前后酵母菌中mRNA的变化，共鉴定出基因6751个，其中2倍以上变化升高的基因102个，下降的基因303个，主要包括碳氮水解酶类、核酸结合转录因子类、氧化还原类、转移类、细胞组分类。

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