大白菜生物钟长周期突变体lcc-1候选基因的鉴定及功能分析

Circadian clock plays an important role in the regulation of plant growth, flowering and resistance. Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis) is one of important vegetable crops, which vegetative leaves are consumed as edible organs. Release of the whole genome information of Chinese cabbage provided important supports for functional genomics research on important traits such as organ development. However the function of most of genes is unclear and lacks of reports, especially the circadian clock related genes regulated growth development and metabolism in Chinese cabbage. In this study, the genetics of the mutant characters were analyzed by using the long-period circadian clock mutant (Lcc-1) and its wild type, with the same genetic background. By means of high-throughput sequencing Mutmap and molecular marker linkage analysis, the candidate genes that influence the prolonged circadian rhythm of Chinese cabbage will be discovered. Using RNA-seq technique, the expression regulation mode of the circadian clock related genes in Chinese cabbage was analyzed. On the basis of the establishment of CRISPR gene editing technology in Chinese cabbage, the function of the key genes related to the biological clock regulated gene expressions and agronomic characters will be revealed by combining the genetic transformation of vacuum infiltration. This project is of great significance to the mining new genetic resources of circadian clock in Chinese cabbage. And it will help analyze molecular interactions of circadian clock genes that provided the theoretical basis, and play an important role in revealing the regulations for circadian rhythm, organ formation and development by circadian clock in Chinese cabbage.

生物钟在植物生长、开花、抗性等性状调控中发挥着重要作用。大白菜是以营养期叶片为食用器官的重要蔬菜作物，全基因组信息的公布为开展器官发育等重要性状的功能基因组学研究提供了条件，但多数基因功能尚不明确，尤其是大白菜调控生长发育及代谢的生物钟相关基因的研究报道很少。本研究以同一遗传背景的大白菜生物钟长周期突变体及其野生型为材料，分析突变性状的遗传方式；利用Mutmap重测序和分子标记连锁分析，发掘影响大白菜生物钟节律延长的候选基因；利用RNA-seq基因表达谱技术，解析大白菜生物钟相关基因的表达调控模式；在建立大白菜CRISPR基因编辑技术基础上，结合真空渗透遗传转化，揭示生物钟关键基因在大白菜表达及性状调控中的功能。该项目对挖掘大白菜生物钟新型基因资源具有重要意义，也将为解析大白菜生物钟相关基因的分子互作提供理论依据，对揭秘生物钟调控大白菜昼夜节律、器官形成和生殖发育具有重要推动作用。

生物钟在植物生长、开花、抗性等性状调控中发挥着重要作用。大白菜是以营养期叶片为食用器官的重要蔬菜作物，全基因组信息的公布为开展器官发育等重要性状的功能基因组学研究提供了条件，但多数基因功能尚不明确，尤其是大白菜调控生长发育及代谢的生物钟相关基因的研究报道很少。本研究以大白菜生物钟长周期突变体lcc-1及其野生型WT为材料，研究发现，lcc-1和WT的生物钟周期、下胚轴、株高、株展、现蕾时间和开花时间等性状均表现为显著或极显著差异。lcc-1长周期表型为半显性遗传；通过RNA-seq技术发现，在25天的WT中27686个基因发生转录，4800个（17.3%）基因有节律性表达，涉及光合作用、植物激素信号转导、次生代谢物的生物合成等众多通路，生物钟调控的基因在淀粉降解反应中占比很大。与拟南芥同源生物钟基因的节律比较，大白菜中一半以上的基因与拟南芥具有相同的转录模式；345个基因在与拟南芥基因组的共线性区域内无对应的同源基因。可见，大白菜在三倍化进程中出现了新的节律基因，也有部分拟南芥同源基因失去了节律。在lcc-1中，3905个基因保持了节律，核心生物钟基因的转录均在lcc-1中推迟；136个基因失去节律，1393个基因获得节律，这些基因大多是由于个别时间点的表达水平差异造成；绘制了大白菜单细胞转录图谱；WT中约12%的代谢物含量具有节律性，而lcc-1中初生代谢物的节律性遭到破坏，大多数氨基酸的含量上升，并且失去了野生型的节律模式；而糖及醇类和核苷酸的含量下降，并且维持在较低的水平。利用MutMap技术鉴定出lcc-1的长周期表型候选基因15个，结合PCR片段测序和KASP标记方法，发现位于大白菜A10染色体的BrPRR7基因可能是lcc-1的候选基因，确定了大白菜BrPRR7蛋白在细胞核中行使功能；对lcc-1和油用白菜‘R500’的F2群体构建了一张含1602个标记的高密度遗传图谱，位于A10连锁群底部的QTL位点仅与BrPRR7基因距离0.8M。该项目对挖掘大白菜生物钟新型基因资源具有重要意义，也将为解析大白菜生物钟相关基因的分子互作提供理论依据。

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