聚乙二醇修饰的金纳米颗粒影响血红蛋白携释氧功能及调节红细胞糖代谢的机制研究

Nanomedicines based on PEG@AuNPs are generally designed to be administered through intravenous injection to increase their bioavailability, it is necessary to investigate the blood compatibility of PEG@AuNPs. Our previous study found that PEG@AuNPs accelerated the aggregation of band3 protein in erythrocyte membrane, the oxygen-carrying capacity and deformability of erythrocytes was decreased consequently, however the mechanism have not been clarified. We speculate there is specific interaction between the PEG@AuNPs and hemoglobin, thus strengthen the bond between the deoxy-hemoglobin and the band3 protein; and PEG@AuNPs may impair the balance of redox system by inhibit pentose phosphate pathway, thus induce oxidative damage in erythrocytes. To verify the hypothesis, we plan to adopt Raman spectra and Isothermal calorimetric titration to research the interaction between 30nm PEG@AuNPs and hemoglobin, and investigate the influence of PEG@AuNPs on glycolytic enzymes activity, location and NADPH production during the deoxygenated process. Finally, we will analyze the influence of PEG@AuNPs on renal EPO expression and oxygen content in distal tissues. Our studies may contribute in elucidating the molecular mechanism of PEG@AuNPs induced oxidative damage in erythrocytes by regulating glucometabolism.

基于金纳米颗粒开发的药物在应用中通常采用静脉注射的方式以提高生物利用度，所以它的血液相容性是一个值得关注的问题。本课题组前期发现巯基聚乙二醇修饰的金纳米颗粒(PEG@AuNPs)会导致红细胞膜上带3蛋白的聚簇化，损伤红细胞携释氧功能和变形能力，但机制尚不明确。我们推测PEG@AuNPs与血红蛋白之间存在特异性相互作用，从而增强脱氧血红蛋白与带3蛋白的结合；并通过抑制磷酸戊糖途径破坏氧化还原平衡从而对红细胞造成氧化损伤。为验证上述理论，我们计划采用拉曼光谱和等温量热滴定研究30nm PEG@AuNPs与血红蛋白的相互作用机制；并观察PEG@AuNPs处理后对糖酵解关键酶活性和定位的影响，并检测NADPH等代谢产物；最后通过动物实验分析PEG@AuNPs对末端组织供氧和肾脏EPO等表达的影响。从而阐明PEG@AuNPs通过调节糖代谢对红细胞造成氧化损伤的机制。

随着多种基于聚乙二醇修饰的纳米金（PEG@AuNPs）开发的药物进入临床研究，贵金属纳米颗粒的血液相容性问题逐渐引起学术界重视。本课题组研究发现PEG@AuNPs被红细胞摄取后会与血红蛋白接触，而拉曼光谱和圆二色谱发现PEG@AuNPs与血红蛋白存在相互作用，并且会导致血红蛋白脱氧。由此我们检测了4.5, 13, 30nm三种粒径PEG@AuNPs对红细胞功能、氧化/还原平衡和能量代谢的影响。.课题组采用了代谢组学技术分析了三种粒径PEG@AuNPs处理后红细胞的代谢产物变化，从代谢组学的角度全面分析37℃孵育条件下三种粒径PEG@AuNPs对红细胞代谢的影响。数据显示三种粒径PEG@AuNPs孵育后红细胞内的磷酸戊糖途径受到了抑制，同时糖酵解途径有明显激活。并且我们采用生物发光法对三种粒径PEG@AuNPs处理后红细胞内ATP、NADP+/NADPH的含量变化进行了检测。数据验证了三种粒径的PEG@AuNPs处理都会对红细胞造成氧化胁迫，并且激活糖酵解。.为检验PEG@AuNPs诱导血红蛋白脱氧的效应是否会影响外周血中红细胞的携释氧功能，我们采用Balb/c小鼠，适应性喂养1周后，实验组小鼠通过尾静脉注射100μL 30nm PEG@AuNPs (0.2mg/ml)，对照组尾静脉注射等体积生理盐水。分别在注射后1，7，14，28天通过鼠尾袖套系统无创检测两组小鼠的血压、脉搏等生理参数，待检测完毕后采用2.5%阿氟丁麻醉小鼠，采用Pericam PSI激光散斑对比成像仪检测小鼠肝脏的血流灌注情况，然后取血进行血常规计数和生理生化指标检测。最后取肾脏组织提取mRNA并进行逆转录实验，检测两组小鼠的EPO和HIF-1α表达情况，分析尾静脉注射PEG@AuNPs是否会影响小鼠重要组织（肝脏）的供氧，以及对造血系统的影响。.数据显示，在尾静脉注射PEG@AuNPs后，小鼠肾脏组织的EPO和HIF-1α相对于对照组无显著变化。而激光散斑显示实验组小鼠的肝脏血液灌注量在注射后先上升后降低，在第14，28天实验组与对照组已无显著性差异。因此我们认为在尾静脉注射PEG@AuNPs后，小鼠主要通过生理代偿来抵消PEG@AuNPs的脱氧效应，PEG@AuNPs进入红细胞后的脱氧效应并未对供氧相关的EPO和HIF-1α基因表达造成影响。

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