基于多色探针熔解曲线分析的高苯丙氨酸血症基因突变的联合检测

Hyperphenylalaninemia (HPA) is the most prevalent autosomal recessive inherited disorder of amino acid metabolism in human and it is also the first neonatal screening program worldwide. HPA is caused by gene alterations, which form the basis for confirmative diagnosis of HPA as well as for therapeutic decision and prenatal diagnosis. Many genes are involved to cause HPA while the mutations are diverse in their types and the mutation sites are widely dispersed. Our experience in molecular characterization of 570 HPA families allowed us insights into HPA regarding the mutation types, frequencies and distributions. In this proposal, we aim to establish an integrated detection system to cover all common HPA causative mutations by using multicolor melting curve analysis (MMCA), a strategy invented by us before. The new detection system would have a clinical sensitivity more than 90%. Accomplishment of this project would provide a reliable and rapid tool for HPA newborn screening and prenatal diagnosis. Moreover, it might also help create a paradigm of molecular diagnosis of many other diseases caused by mutations in multiple genes.

高苯丙氨酸血症 (Hyperphenylalaninemia, HPA) 是人类最常见的遗传性氨基酸代谢病，是全球新生儿筛查的首个项目。HPA发病机制是基因突变，基因突变检测既是确诊HPA的主要手段，又是治疗选择和产前诊断的关键依据。引起HPA的基因突变涉及多个基因，且突变类型多样、位点分散，大大增加了其检测的难度，在很大程度上限制了基因检测的临床应用。申请者前期通过对570个HPA家系基因突变的研究，基本弄清HPA基因突变类型、频率和分布等特点。本项目中，我们拟利用自主发明的多色探针熔解曲线分析技术，研究建立覆盖我国HPA常见突变类型的集成基因突变检测体系，使HPA基因检测灵敏度达到90%以上。该体系的建立，将为HPA的筛查和诊断提供可靠且快速简便的检测手段，并为其它多基因病的分子诊断提供借鉴。

高苯丙氨酸血症 (Hyperphenylalaninemia, HPA) 是人类最常见的遗传性氨基酸代谢病，是全球新生儿筛查的首个项目。HPA发病机制是基因突变，基因突变检测既是确诊HPA的主要手段，又是治疗选择和产前诊断的关键依据。然而，引起HPA的基因突变涉及多个基因，且突变类型多样、位点分散，这大大增加了其检测的难度，且在很大程度上限制了基因检测的临床应用。在本研究中，通过对中国人群HPA基因突变谱分析，申请人利用具有自主发明的多色探针熔解曲线分析技术，综合运用Gap-PCR、多重不对称PCR、环突探针设计策略，建立了可同时覆盖120余种PAH基因点突变、10种PAH大片段缺失以及20种PTS基因突变的的HPA基因突变联合检测体系。所建立的检测体系在封闭的PCR反应管中完成，样本在完成DNA提取后，在3小时内即可获得突变筛查结果，其最低检测限为50 pg人基因组DNA/反应，不同来源的样本如全血、唾液、干血斑、羊水等均可提取到足量的DNA用于检测。分析性能评估和多中心临床验证结果显示该体系具有良好的灵敏度、特异性、准确性和临床适用性。与目前基于Sanger测序、高通量测序、多重连接依赖的探针扩增（MLPA）技术等相比，本项目所建立的检测体系可以在同一实时PCR平台完成多种点突变和大片段缺失的同时检测，无需任何PCR后处理，具有简便、快速、准确、自动化程度高、成本低的特点，在临床具有广阔的应用前景。该项目的完成，不仅为HPA的筛查和诊断提供可靠且快速简便的检测手段，并为其它复杂多基因遗传病的分子诊断提供借鉴。

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