可利用纤维素盐单胞菌PHA合成途径的改造

To reduce the expense of PHA is one of the major concerns in the PHA production.In order to establish economically feasible fermention systems to obtain PHAs from cheap carbon sources, metabolic engineering and pathway construction for PHA biotechnological production in halomonas sp.LS21 will be performed. Halomonas sp.LS21 can utilize straw cellulose to produce PHA, but the ability for PHA accumulation of halomonas sp.LS21 needs to be further improved. A mutant of Halomonas sp.LS21 deleted with fadA and fadB will be constructed. Then PHA synthesis genes phaC, phaA and phaB will be coexpressed to enhance utilization of cellulose and improved PHA accumulation in Halomonas sp.21.Plasmid stability in recombinant microorganisms is a very important requirement for highly efficient plasmid-based production processes in biotechnology. To stably maintain plasmids, a novel addiction system will be used in this project. This addiction system is based on a halomonas sp.LS21 knockout mutant of the ispH gene coding for 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyldiphosphate reductase. In addition, a strong native promoter and native OriC sequence will be screened to provide the PHA synthesis genes expression.Based on the recombinant halomonas sp.LS21, a sterilization free and continuous fermentation process will be developed, which provide a new solution for reducing cost of PHA production.

针对PHA生产中原料成本高，发酵过程灭菌环节耗能，生产工艺不连续等问题，利用农业废弃秸秆纤维素为底物，以自主筛选的可利用纤维素盐单胞菌Halomonas sp.LS21为底盘生物（已获得菌株的全基因组序列），对其PHA合成代谢通路进行基因工程改造。敲除fadA和fadB基因，改造脂肪酸β氧化途径；筛选并克隆LS21自有强启动子及复制起始位点(OriC)序列；异源表达来自PHA高产菌株的乙酰辅酶A合成途径中PHA合成相关基因phaC、phaA、phaB；组装以上各原件序列并在Halomonas sp.LS21 中表达，以提高重组菌株的PHA积累能力。同时，敲除LS21基因组中必须基因ispH，构建非依赖抗生素维持的质粒表达系统。围绕得到的具纤维素酶活性盐单胞高产重组菌株，建立配套的秸秆纤维素前处理方法和连续无灭菌发酵工艺，从而为降低PHA生产成本提供新的解决方案。

聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，简称PHA）作为一类由微生物合成的环境友好型高分子聚酯材料，具有良好的发展前景。目前阻碍其大规模应用的主要问题是复杂的发酵过程导致的居高不下的成本问题。为解决这一问题，本研究选择了发展利用嗜盐耐碱盐单胞细菌为细胞工厂、以NaOH/Urea碱性纤维素溶液为底物的开放连续发酵新体系。从特殊盐碱环境中筛选出一株能够利用纤维素的嗜盐耐碱盐单胞细菌—Halomonas campaniensis LS21。基于其特殊的耐受盐碱条件的生物学特性，建立了一套以NaOH/Urea碱性纤维素溶液为基质的开放无灭菌发酵工艺。 降低了底物成本、减少了发酵过程中灭菌环节所需能耗。.对H. campaniensis LS21进行了工程改造。通过构建过表达PHA聚合酶PhaC、β-酮基硫解酶PhaA、NADPH依赖型乙酰乙酰辅酶A还原酶PhaB三个PHA合成关键酶基因，带有多拷贝孔道蛋白Porin启动子和复制起始位点OriC序列（提高质粒稳定性）的质粒系统，使重组H. campaniensis LS21在利用不限氮的混合培养基条件，PHA积累量从野生型的26.2%提高到74.3%。并在7升的发酵体系中实现了周期65天的长时无灭菌连续发酵，菌株最大干重达到69 g/L。重组菌株在以葡萄糖为底物时，电镜观察到其胞内可形成单颗粒PHA颗粒。.对H. campaniensis LS21进行了基因组测序，获得了基因组完成图进行了标注，其基因组大小为3.63 Mb，GC比为53.5%，有3791个 CDS区。参照KEGG、COG等6个数据库对其基因组进行了注释，与盐单胞属标准模式菌株Halomonas elongata DSM 2581及另一株PHA高产盐单胞菌Halomonas sp. TD01进行了基因组共线性分析。H. campaniensis LS21有366条代谢通路，其中底物降解通路168条，H. campaniensis LS21有纤维素酶相关基因3类4个，包括编码内切-1,4-β-木聚糖酶的编码基因。这些结果为应用合成生物学手段改造H. campaniensis LS21，提高其纤维素利用效率提供了线索。也为将其改造成为基因组精简化的新型盐单胞菌底盘生物提供依据。

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