基于转录组分析不同李氏杆菌感染巨噬细胞过程中sRNA的调控机制

In the past, small nocoding RNA (sRNA) was considered “junk RNA”. However, recent studies have found that sRNA plays a very important role in life activities and are called “dark matter” to lives. The studies about transcriptome analysis of sRNA regulatory mechanisms during different listeria spp infected in macrophages have not been reported so far. This study is the first time to analysis change rule of sRNA in which different listeria spp infected in macrophages at different periods from transcriptome level. And reveal correlations of sRNA with Listeria virulence, phenotype, metabolism and other aspects. Through construction virulence-related sRNA deletion strains, infection to animal and host cell, and measured different expression of target gene, we discuss the molecular mechanism of sRNA regulated its target gene, formed signal transduction pathway, and affected bacterial virulence. Try to confirme that sRNA play an important role in the resistance to the external environment and adapt to the intracellular survival. Established foundation for design of the original listeria infections associated vaccines and drugs using sRNA as target.

小RNA(small nocoding RNA，sRNA)过去被认为是“垃圾RNA”，但近年来的研究发现sRNA扮演着极其重要的角色，被称为生命活动的“暗物质”。而基于转录组分析sRNA在不同李氏杆菌感染巨噬细胞过程中的调控机制的研究，迄今还未见有报道。本研究首次在转录组水平上分析并验证不同李氏杆菌在侵入巨噬细胞不同时间段其sRNA的变化规律，揭示了sRNA与李氏杆菌毒力、表型、代谢等方面的相关性；通过对毒力相关sRNA分子构建基因缺失株，进行动物、细胞感染试验，测定靶基因的表达差异情况，探讨了从sRNA对靶基因的调控，到信号转导通路的形成，最终实现对细菌毒力影响的机制。试图证实sRNA在抵抗外界环境及适应胞内生存中发挥的作用。为以sRNA为靶标，设计抗李氏杆菌感染的相关疫苗和药物等方面奠定基础。

近年来的研究发现sRNA扮演着极其重要的角色，被称为生命活动的“暗物质”。基于转录组分析sRNA在不同李氏杆菌感染巨噬细胞过程中的调控机制，本研究做了如下研究：（1）将不同李斯特菌侵染巨噬细胞，分别提取侵染后0h、4h、8h李斯特菌的总RNA进行转录组测序，对测序结果进行分析，筛选出578个差异表达基因，其中有487个下调基因，91个上调基因。将差异表达的基因在KEGG数据库中进行注释比对，在所有差异表达基因其中有710个基因被注释到170种不同的生理途径中。同时发现了420个sRNA的新基因，并对其靶基因进行预测，sRNA发现预测的靶基因富集到细菌毒力、甲基转移酶的活性、ABC转运蛋白的功能、复制DNA解旋酶等功能上。（2）根据转录组分析发现sRNA分子sr011，有可能参与LM的毒力与入侵相关，对其功能进行验证。利用PCR分别扩增获得sr011基因缺失片段，构建重组穿梭质粒pKSV7-△sr011。电转化到LM中，得到基因重组缺失株LM-△sr011。在37℃条件下培养LM野生株和LM-△sr011菌株，两者生长差异不显著，该结果证实sr011基因缺失对37℃生长特性没有影响。（3）将LM与构建的sr011基因缺失株分别感染巨噬细胞小鼠，统计胞内细菌总数、计算细胞粘附率以及小鼠存活率，通过RT-PCR毒力基因表达量检测的方法检测五个毒力相关因子的表达量，并分析缺失株与野毒株的致病性差异。结果显示，与LM相比，LM-△sr011缺失株的粘附率和侵袭力均下降；感染小鼠后肝、脾、肺载菌量减少；毒力基因SigmaB的转录水平显著下降。提示sr011基因对SigmaB基因的表达具有调控作用。. 综上，通过本项目研究，筛选到不同李氏杆菌入侵巨噬细胞时的主要差异sRNA分子的数量及参与调控的途径，并对sRNA分子sr011基因的功能进行初步验证。该研究为以sRNA为靶标，设计抗李氏杆菌感染的相关疫苗和药物等方面奠定了基础。

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