一条LBP/CD14抑制肽的体外定向进化及其抗内毒素活性的研究

LBP/CD14位于脂多糖（LPS）致炎信号通路的上游，且对LPS具有增敏作用，在内毒素性急性肺损伤的发病中居于重要地位。拮抗LBP/CD14无疑是防治内毒素性急性肺损伤的理想策略。由于LBP/CD14对LPS的增敏作用需依赖LBP与CD14的结合，因此封闭CD14与LBP的结合位点可能具有抑制LPS的致炎作用而不影响LBP中和LPS的优点。我们前期的工作寻找到一条LBP/CD14抑制肽，其氨基酸序列为FHRWPTWPLPSP。该抑制肽在体外及动物体内均表现出较好的抗内毒素活性，但其工作浓度较高，抗内毒素的效率还有待提高。为此我们拟采用DNA shuffling及T7噬菌体展示技术定向进化并筛选具有更高活性的LBP/CD14抑制肽突变体，并观察其抑制LPS致炎作用及对内毒素性急性肺损伤转归的影响，以期获得更理想的防治内毒素性急性肺损伤的方法。

脂多糖结合蛋白(LBP）及其配体CD14（LBP/CD14）位于脂多糖（LPS）炎症信号通路的上游，对LPS具有增敏作用。封闭LBP与CD14的结合位点可望既阻断LPS介导的炎症反应，又不影响LBP对LPS清除作用，为内毒素急性呼吸窘迫综合征提供早期的治疗策略。前期我们已经通过噬菌体十二肽库筛选得到一条模拟肽MP12，并证实该模拟肽具有抗内毒素的功能，但其活性还有待提高。本研究通过易错PCR对LBP的C端序列进行突变，并将突变产物与T7噬菌体连接构建噬菌体展示文库。采用亲和淘选及竞争抑制筛选获得与LBP竞争结合CD14的11个阳性克隆。DNA测序发现，这11个阳性克隆中有9个克隆在位于LBP的C端的第287位氨基酸处发生了T(苏氨酸)到M（蛋氨酸）的突变。我们根据这9个克隆的共同序列合成了一条从LBP第252位到291氨基酸的多肽，命名P1，其中第287位氨基酸为M，其氨基酸序列为：FHRNHRSPVTLLAAVMSLPEEHNKMVYFAISDYVFNMASL。而另一条含有前期筛选得到的模拟肽MP12的多肽长度仍然是LBP的第252位到291氨基酸，只是在第252位到263位氨基酸由MP12替代，其氨基酸序列为：FHRWPTWPLPSPAAVMSLPEEHNKMVYFAISDYVFNTASL。体外实验部分，我们观察了P1和MP12对LPS诱导的U937细胞TNF-α表达及NF-κB活化的影响。结果表明，成熟的U937细胞经LPS刺激后可表达TNF-α及导致NF-κB活化，在LBP的存在下其表达量显著增高（p<0.01）。P1和MP12均能抑制这两者的表达和活化，且P1的抑制能力优于MP12(P<0.05)。动物实验的结果与体外细胞实验的吻合，经P1和MP12治疗后，LPS诱导的急性肺损伤大鼠的动脉血氧分压和氧合指数得到改善，肺组织损伤表现减轻，病理评分较LPS组改善(P<0.01)。P1和MP12治疗组大鼠的肺组织通透性得到改善，急性肺损伤发生率及死亡率降低（P<0.01），且P1的治疗效果较MP12明显（P<0.05）。实验结果提示，本研究采用ep-PCR和噬菌体展示技术获得了LBP第287位氨基酸由T突变为M的新的多肽（P1）。该多肽在体内、外具有更高的抗内毒素活性，提示LBP C端第287位氨基酸可能对LBP与CD14结合具有重要意义。

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