携带双自杀基因的可回复永生化肝细胞株优化及应用

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项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    81100309
  • 项目类别：
    青年科学基金项目
  • 资助金额：
    23.0万
  • 负责人：
    毕杨
  • 依托单位：
    重庆医科大学
  • 学科分类：
    H0311.肝保护和人工肝
  • 结题年份：
    2014
  • 批准年份：
    2011
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2012-01-01 至2014-12-31

项目摘要

生物人工肝是肝脏功能替代治疗的一种重要技术方法，细胞的稳定来源及安全性是急需解决的关键问题。已知SV40T能促进原代肝细胞体外永生化增殖，可获得足够数量的细胞，但其长期存在于细胞并导入体内可能导致恶性转化。近年来，围绕如何降低SV40T永生化肝细胞应用于人体的危险性开展了大量研究。鉴于现有可回复永生化方法的缺陷，我们优化设计了一种携带双自杀基因（胞嘧啶脱氨酶CD及单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-tk）的可诱导敲除系统，创造性地将Cre-LoxP 位点重组技术用于双自杀基因的可控性表达，通过逆转录病毒系统一次性导入SV40T、CD及HSV-tk基因，构建一种新型的可回复永生化肝细胞株。该细胞株既能在体外不断增殖又能保证肝细胞的表型和正常功能，在体内应用前将可疑致癌和抑制肝细胞功能的永生化基因敲除，并且进入体内的外源细胞也能在药物作用下自杀，有望为生物人工肝技术提供一种稳定、安全的理想肝细胞来源。

结项摘要

中文摘要(对项目的完成情况及取得成果做简单概述，1000字以内)：.本项目将Cre-LoxP定点敲除系统运用于双自杀基因的可控性表达，获得一种可回复永生化人肝细胞株，保证获得足够来源的细胞，并具有良好的生物安全性，解决目前生物人工肝技术中细胞来源缺乏及体内应用的安全性问题。具体研究结果如下：1. 比较了成体肝细胞与胚胎肝干细胞的体外分离培养及增殖和成熟分化的生物学特性：胚胎来源的HP14.5d肝祖细胞较成体肝细胞LC3m增殖能力强，能够高表达肝干细胞的标志，低表达或不表达特异性的成熟肝细胞标志，属于低分化阶段的肝实质细胞， 2%HS+0.1μmol/L Dex+10ng/mlHGF+20ng/mlFGF4诱导后可向成熟肝细胞分化，ICG摄取和糖原合成功能显著增强，更适用于肝细胞移植的种子细胞。2. 采用两步法成功构建了携带双自杀基因的可回复永生化肝细胞株，该细胞株能分别表达SV40T永生化基因和CD、HSV-tk双自杀基因，并在Cre-Loxp位点特异性重组下实现HSV-tk的可控性表达，细胞在裸鼠皮下不成瘤，生物安全性好，并在5-FC前体药物的作用下选择性自杀。3. 建立了不同CCL4浓度诱导的急性肝衰竭小鼠模型，其中2%CCl4的诱导模型肝脏损伤适度，自身修复能力有限，可反应肝细胞移植治疗的效果。肝细胞移植可提高模型小鼠存活率，恢复肝脏指数，显著改善AST和ALT水平，逆转肝脏的病理改变，对肝损伤具有较强的修复作用。

项目成果

期刊论文数量（10）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
Conditionally immortalized mouse embryonic fibroblasts retain proliferative activity without compromising multipotent differentiation potential.
条件永生化小鼠胚胎成纤维细胞保留增殖活性而不影响多能分化潜能
  • DOI：
    10.1371/journal.pone.0032428
  • 发表时间：
    2012
  • 期刊：
    PloS one
  • 影响因子：
    3.7
  • 作者：
    Huang E;Bi Y;Jiang W;Luo X;Yang K;Gao JL;Gao Y;Luo Q;Shi Q;Kim SH;Liu X;Li M;Hu N;Liu H;Cui J;Zhang W;Li R;Chen X;Shen J;Kong Y;Zhang J;Wang J;Luo J;He BC;Wang H;Reid RR;Luu HH;Haydon RC;Yang L;He TC
  • 通讯作者：
    He TC
重组siRARγ腺病毒构建及其对小鼠肝脏祖细胞分化的影响
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2014
  • 期刊：
    基础医学与临床
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    周建武;何昀;龚梦嘉;毕杨
  • 通讯作者：
    毕杨
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5-氮杂胞苷促进肝祖细胞终末分化
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    --
  • 期刊：
    Molecular Medicine Reports
  • 影响因子：
    3.4
  • 作者：
    He, Yun;Cui, Jiejie;He, Tongchuan;Bi, Yang
  • 通讯作者：
    Bi, Yang
Adenovirus-mediated RAR-beta over-expression enhances ATRA-induced neuronal differentiation of rat mesenchymal stem cells
腺病毒介导的RAR-β过表达增强ATRA诱导的大鼠间充质干细胞神经元分化
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2013
  • 期刊：
    Archives of Medical Science
  • 影响因子：
    3.8
  • 作者：
    Bi, Yang;Gong, Min;He, Yun;Wei, Xiaoping;Chen, Jie;Li, Tingyu
  • 通讯作者：
    Li, Tingyu
AP2alpha;荧光素酶报告基因的构建及在 BMPs 诱导成骨分化研究中的应用
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2013
  • 期刊：
    南方医科大学学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    龚梦嘉;周建武;毕 杨
  • 通讯作者：
    毕 杨

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其他文献

体外诱导微环境对骨髓间充质干细胞成神经分化的影响及分化后的自发逆转现象
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    陈洁
大鼠白细胞介素-6重组腺病毒构建及初步鉴定
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    陈洁
分泌性卷曲相关蛋白3影响小鼠胚胎肝干细胞体外成熟分化的实验研究
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  • 发表时间：
    2011
  • 期刊：
    华中科技大学学报(医学版)
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    贺引;蒋昌科;何昀;冯涛;毕杨
  • 通讯作者：
    毕杨

其他文献

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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