磁性多脂肪酶复合固定化模型构建及其在生物柴油转化中的应用研究

Due to limited energy reserves and increasing environmental pressures, green and efficient production of biodiesel has attracted more and more attention. In particular, enzymatic biodiesel production showed unique superiority over conventional chemical catalytic processes. Although many methods have been developed for enzymatic biodiesel production, they mainly aimed at the regulation of the catalytic performance of a single lipase. Because of the difference in regioselectivity and substrate specificity of lipases, lipase selection has a significant importance for biodiesel production from various renewable raw materials. To solve this problem, we try to construct hybrid magnetic metal-organic framework for efficient enzyme immobilization of two lipases showing different specificities, aiming at reducing the interference between different lipases and the internal mass transfer resistance in the microcapsules. On the basis of the above experiments, immobilized composite lipases with high activity, good stability and easy recovery will be obtained and further applied in biodiesel conversion of waste oils, developing a simple, efficient and green synthetic method for biodiesel production. Moreover, the coordination mechanisms of different functional groups on the activity of immobilized lipase will be studied in detail. This research is of great significance to promote green and efficient production of biodiesel and may provide a new idea for the establishment of efficient multi-enzyme immobilization.

有限的能源储备和日益加剧的环境压力，使得生物柴油的绿色高效转化获得越来越多的关注。酶促生物柴油转化具有化学法无法比拟的优势，然而目前发展的方法主要针对单一脂肪酶的催化性能调节。由于脂肪酶对甘油酯的区域选择性差异，导致脂肪酶的种类对不同原料油的生物柴油转化率有显著影响。为突破这一瓶颈，本项目拟将两种具有互补区域选择性的脂肪酶共同固定在同一载体上。为了降低不同酶分子间的抑制作用和固定化结构内部的传质阻力，结合磁性纳米粒子和金属-有机框架材料的优势，构建双层固定化酶模型，实现两种酶空间分离的共固定化。筛选得到活性高、稳定性好、易回收的固定化多脂肪酶复合酶。进而，用于废弃油脂的生物柴油转化，发展一种简单、绿色、高效的生物柴油合成方法。深入研究不同载体和固定化方法对脂肪酶酶活保留的影响规律。本项目的研究为多种脂肪酶的共同固定化提供新的思路，对推进生物柴油的绿色高效转化具有重要意义。

利用低质量的原料发展高效的生物柴油生产是实现碳达峰和碳中和目标的一条有效途径，对创造绿色、低碳的循环经济至关重要。脂肪酶催化废油的酯交换反应制备生物柴油，可以避免皂化和废水问题，从而提高工艺效率。但是，油脂是由不同的甘油三酯混合而成，脂肪酶对这类混合物型底物显示出不同的选择性。要找到一种理想的脂肪酶，对如此广泛的底物有效，是一个巨大的挑战。为突破这一瓶颈，本项目提出结合两种酶的选择性互补的优势，构建磁性的多酶共固定化酶模型，实现两种酶的共固定化，从而提高在生物柴油合成中的催化效率的新思路。首先，基于表面活性剂印迹和交联酶聚集体法，实现了非特异性的洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶（BCL）和sn -1,3 特异性疏绵状噬热丝胞菌脂肪酶（TLL）的共固定化，并考察了其催化废油制备生物柴油的活性。在最佳反应条件下，生物柴油产率可达98.7%，显著优于单一固定的酶，证明了两种酶的协同作用。为了证明结构专一性互补对提高反应效率的影响，sn -1,3 特异性的米曲酶脂肪酶（AOL）和米黑根毛霉脂肪酶（RML）被吐温80印迹活化后快速包埋在在磁性壳聚糖微囊中，在最佳条件下达到98.5%的产率，分别是单一固定AOL和 RML的1.3和1.6倍。同时，由于可耐受甲醇的AOL和热稳定的RML的协同作用，共同固定化的脂肪酶在过量甲醇和不同温度下，显示出比单一脂肪酶的更高的活性。为了提高固定化酶的稳定性，并降低固定化酶结构内的质量扩散限制，BCL和TLL被共价固定在环氧基硅烷修饰的磁性载体上，并采用响应面法优化了固定化的条件。与单一酶和混合使用的酶相比，共固定化的酶在活性和反应速率方面均有明显的提高，12小时即可达到98.4%产率，且在六种不同的原料油的酯交换反应中，均可达到90-98%的生物柴油产率，表明BCL和TLL的完美协同效应在共同固定化以后有明显的提高。同时，在9个循环后仍保持77%的初始活性。高催化效率、广泛的底物适应性和良好的可重复使用性表明该高效、经济的固定化酶有进一步的应用潜力。

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