基于ChIP-Seq/SILAC研究KLF15抑制系膜细胞增殖的分子机制

Mesangial proliferative glomerulonephritis is a major cause of chronic kidney disease, and to inhibit the proliferation of mesangial cells effectively is the key point to treat it. Therefore, to clarify the molecular mechanism of mesangial cell proliferation, would provide new ideas and theoretical basis to clinical treatment of mesangial proliferative glomerulonephritis. Our previous study found that the transcription factor KLF15 can inhibit the proliferation of mesangial cells. But the exact molecular mechanism is unclear. This project intends to adopt advanced technology ChIP-seq couple with SILAC-LC/MS to analysis deeply the target regulation gene, binding sites as well as the biological pathways of KLF15 inhibiting mesangial cell proliferation, then presentate the molecular networks of KLF15 regulation mesangial cell proliferation. Soon after, basing on building KLF15 gene modified mice and establishing mesangial proliferative glomerulonephritis model, we verify the characteristics of changes about these target genes and molecular networks, identify the relationship between these changes and pathological, renal function. Through these studies, we hope to reveal the molecular mechanisms regulating cell proliferation of the transcription factor KLF15 in mesangial proliferative glomerulonephritis, and screened the therapeutic target for mesangial proliferative glomerulonephritis, it will provide a solid theoretical foundation for developing new drugs and effective treatment about mesangial proliferation glomerulonephritis.

系膜增生性肾炎是导致慢性肾脏病的主要病因, 而治疗该疾病的关键环节就是有效地抑制系膜细胞增殖。因此，阐明系膜细胞增殖的分子调控机制，将为系膜增殖性肾炎的临床治疗提供新的思路和理论依据。我们的前期研究发现转录因子KLF15可以抑制系膜细胞的增殖，但其具体的分子机制尚不清楚。本课题拟采取先进的ChIP-seq联合SILAC-LC/MS 技术，对KLF15抑制系膜细胞增殖的靶向调控基因及其结合位点，以及相关通路进行系统的生物学深度分析，描绘出KLF15调控系膜细胞增殖的分子网络。构建KLF15的基因修饰小鼠并建立系膜增生性肾炎模型，验证上述靶基因及相应分子网络的变化特点以及与肾脏病理改变、肾功能的变化关系。通过上述研究，我们期望揭示转录因子KLF15在系膜细胞增生性肾炎中调控系膜细胞增殖的分子机制，筛选出针对系膜增殖性肾炎的治疗靶点，为新药的研发和系膜增殖性肾炎的有效治疗打下坚实的理论基础。

项目背景：系膜增生性肾炎是导致CKD的重要原因之一，该病在病理上主要以肾小球系膜细胞增殖和系膜基质增多为主要特征。转录因子在细胞增殖的调控中起着至关重要作用，前期的研究发现转录因子KLF15在体外实验中可以抑制系膜细胞的增殖，但其具体的分子机制尚未完全阐明。本课题在利用ChIP-seq和SILAC-LC/MS筛选得到KLF15抑制系膜细胞增殖的靶向基因；通过体外实验研究KLF15调控靶向基因抑制系膜细胞增殖的分子机制。.研究内容：.（1）综合ChIP和SILAC结果，我们分析得到52个共同差异表达的基因（蛋白）以及3类Modifs，其中5个蛋白与细胞增殖最为相关。最终筛选出SUMO1作为KLF15调控系膜细胞增殖的靶向基因。利用ChIP-PCR和荧光素酶报告基因验证KLF15可以直接结合SUMO1的启动子区并发挥转录调控作用。IPA数据库分析发现P53可能是SUMO1直接作用的下游分子并参与细胞增殖进程。.（2）高糖和PDGF诱导系膜细胞增殖后，KLF15和SUMO1的基因和蛋白水平表达均降低。证明KLF5和SUMO1在增殖系膜细胞中存在相互作用的关系。.（3）HRMC转染过表达KLF15后， SUMO1、P53以及SUMO1-P53表达升高，细胞增殖降低；转染过表达SUMO1后，P53、SUMO1-P53表达升高，细胞增殖降低；转染SUMO1的siRNA后，KLF15表达无明显改变，SUMO1、P53、SUMO1-P53表达降低，细胞增殖升高；共转染KLF15和SUMO1的siRNA后，KLF15表达无明显改变，SUMO1、P53、SUMO1-P53表达降低，细胞增殖升高。.（4）Thy-1肾炎模型的大鼠肾脏组织的KLF15、SUMO1和P53表达量自第0d、3d、5d逐渐降低，第5d最低，第7、10天表达量逐渐回升。免疫组化提示肾系膜细胞表达的PCNA自0d、3d、5d逐渐增加，第5d最高，第7、10d逐渐减低。说明随着系膜增生肾炎的进展KLF15、SUMO1和P53的表达逐渐降低，系膜细胞增殖逐渐加重，而Thy-1肾炎模型的自限性，表现在第10d以后各指标逐渐恢复。.科学意义：KLF15通过调控SUMO1表达，影响P53的SUMO化水平，从而实现抑制系膜细胞增殖的作用。

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