先天性双侧完全型隐眼的发病分子机制研究

Congenital bilateral complete isolated cryptophthalmos, an extremely rare blindness-malformation causing oculopathy, is characterized by the absence of the eyelids which are replaced by skin extending in continuity with the cheek over the orbit in combination with no systematic abnormalities. With whole-exome sequencing and linkage analysis in three nuclear families affected by bilateral complete isolated cryptophthalmos, we initially found that all the affected children can be detected with the compound heterozygous mutations in the FREM2 gene on chromosome 13, which were inherited from the paternal and maternal origin separately. One mutation is a missense mutation of nucleotide C6499T (encoding abnormal protein) and the other is a stopgain mutation of different loci (encoding degradable truncated protein) in the same FREM2 gene. It can be speculated that, the novel compound heterozygous mutations in FREM2 may account for the abnormal eyeball development so as to cause cryptophthalmos. In our study, we aim to further prove the relationship between the compound heterozygous mutations in FREM2 and cryptophthalmos with gene cloning and CRISPR/Cas9 techniques. Meanwhile, we will investigate the pathogenic process and molecular mechanism of embryonic eyeball development to promote the diagnosis and management of blind-causing eye diseases.

先天性双侧完全型隐眼是一种终生致盲致畸的极罕见眼病，发病机制至今未明。患儿出生即表现双眼睑缺失，眼表面完全被连续性皮肤覆盖，眼眶内仅有眼球遗迹或完全无眼球，且未合并其它发育异常。我们前期对3个隐眼核心家系进行全外显子测序及连锁分析，首次发现患儿13号染色体上FREM2基因均有遗传自父系和母系的复合杂合子突变：一条染色体均是核苷酸C6499T发生错义突变，编码出异常蛋白；另一条染色体在不同位点上发生终止突变，翻译出无活性的短肽而被降解。我们推测FREM2基因的这种复合杂合子突变遗传可能对眼球发育影响重大，并导致隐眼发生。本项目拟利用基因克隆和CRISPR/Cas9介导的基因点突变构建小鼠模型，进一步证实FREM2基因以C6499T错义突变为共同特征的复合杂合子遗传模式与隐眼发生的关系；同时通过研究模型鼠的胚胎眼发育过程，阐明隐眼发病和眼正常发育的分子调控差异，提高致盲眼病的防治水平。

隐眼是一种先天性疑难罕见眼病，其特征为眼睑畸形合并眼球发育不良。患儿外观畸形并且终生盲，多数完全丧失了社会功能，给家庭和社会带来了沉重的负担。目前尚无隐眼相关的产前诊断标准，因此在产前筛查中极易漏诊。同时，由于缺乏对该病的病理认识，仍没有合适的治疗方法能够对在出生后挽救患者的视功能。此外，由于缺乏合适的动物模型，隐眼致病基因在眼部发育过程中的分子机制尚未完全阐明。本研究旨在进一步明确先天性双侧完全型隐眼的临床特征，揭示双侧完全型隐眼家系的致病基因和相关突变，针对FREM2基因新突变开展体外和体内功能研究，为探索隐眼的致病机制和新型临床治疗方案奠定基础。.本研究共纳入三例无血缘关系并诊断为先天性双侧完全型隐眼的患儿，通过全外显子测序和Sanger测序验证查找致病基因和突变；根据隐眼患儿的致病基因和突变特点，构建野生型和突变型FREM2基因的HEK-293T细胞，通过Celigo细胞计数和Transwell实验观察和检测FREM2基因新突变对HEK-293T细胞功能的影响，并通过免疫共沉淀实验研究其对FRAS1/FREM蛋白复合物稳定性的影响；并利用成簇规律间隔短回文重复序列介导的基因组编辑技术，构建携带Frem2复合杂合突变的小鼠模型。.本研究进一步明确了先天性双侧完全型隐眼的临床特征，并从三个家系中鉴定了FREM2基因新突变，提示先天性双侧完全型隐眼具有高同质性遗传模式；揭示双侧完全型隐眼家系的致病基因和相关突变，证实了FREM2基因新突变可影响细胞迁移和导致FRAS1/FREM蛋白复合物稳定性异常；针对FREM2基因新突变开展体外和体内功能研究，在Frem2R725X/R2156W复合杂合突变小鼠中成功重现了人的隐眼表型，观察到模型小鼠合并有角膜组织紊乱和虹膜发育不全等眼前段缺陷，阐明隐眼发病和眼正常发育的分子调控差异，为隐眼的产前诊断和临床干预提供新靶点。本研究将为产前筛查以及患儿家庭遗传咨询提供帮助，以降低患病率并杜绝患儿家长和亲属再生育时的患病风险。同时可建议将隐眼列入孕前常规筛查项目，促进优生优育，减轻患者家庭和社会的沉重负担。

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