载siRNA和砷剂免疫纳米微粒靶向治疗胰腺癌的研究

胰腺细胞癌变是多步骤多基因突变的结果，如K-ras高突变率和抗凋亡因子Bcl-2表达上调等，这可作为RNA干扰（RNAi）沉默肿瘤生长和中药三氧化二砷（As2O3）诱导治疗的有效靶位。如何在体内把大量siRNA和As2O3定向导入靶细胞是应用RNAi和诱导癌细胞凋亡治疗恶性肿瘤的关键问题。本课题拟采用我们已建立的RNAi技术、合成载基因纳米和人源化单链抗体（ScFv）技术，使用抗CD44v6蛋白人源化单链抗体（ScFv）为靶向抗体，构建载siRNA和As2O3具有靶向缓释功能的复合型免疫纳米微粒，分别在体外内作用胰腺癌细胞和治疗荷瘤鼠模型以评估其对高表达CD44v6蛋白胰腺癌细胞靶向性、沉默突变K-ras基因，诱导癌细胞凋亡达到抑制胰腺癌生长的抗癌作用，开发具有靶向性的载siRNA/ As2O3复合型高效低毒抗癌纳米载体药物。

本课题在前期工作基础上分三部分完成。第一部分构建纳米基因载体向肿瘤细胞输送siRNA：①构建纳米基因载体PEG-PLL，研究其复合siRNA能力、粒径和表面电位、细胞毒性、转染效率。②使用PEG-PLL将靶向突变KRAS基因的siRNA（siKRAS）导入胰腺癌PANC-1细胞内，观察沉默突变KRAS对胰腺癌PANC-1细胞生物学功能的影响。③合成抗人粘附因子CD44v6单链抗体（scFvCD44v6）（前期工作基础），构建免疫靶向纳米载体scFvCD44v6-PEG-PLL，活体荧光呈像连续观察scFvCD44v6-PEG-PLL/siRNA复合物在体内的分布，并观察载siKRAS纳米微粒的体内抑瘤效果。第二部分构建纳米囊泡向肿瘤细胞输送砷剂：①制备PEG-PDLLA/As纳米微粒（As-NPs）和 scFvCD44v6-As-NPs，并详细研究其特性；② 活体荧光呈像连续观察scFvCD44v6-As-NPs复合物在体内的分布。③ 观察纳米砷的体内抑瘤效果。第三部分将siRNA-NPs和As-NPs联合作用于胰腺癌细胞，在体外内实验中观察siRNA和砷剂的协同抗胰腺癌作用。结果显示：PEG-PLL/siKRAS复合物转染PANC-1细胞后可有效地沉默突变KRAS基因，抑制PANC-1细胞增殖、克隆形成能力下降、细胞周期阻滞、迁移和侵袭能力减弱、VEGF分泌减少。scFvCD44v6修饰的靶向载体能够在体内外增加siKRAS对胰腺癌细胞的转染，并获得更强的抗瘤效果。scFvCD44v6修饰的载砷囊泡可在体内外提高胰腺癌细胞内的砷浓度，获得更强的抗瘤效应。以纳米微粒为载体将siKRAS与砷剂联合应用于胰腺癌治疗，在体内外均得到显著的协同作用。本研究结果提示偶联抗CD44v6 scFv的靶向纳米载体可在体外、体内向胰腺癌细胞输送更多的siRNA和砷剂，二者联合应用于抗胰腺癌可获得显著的协同抑瘤效应。

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