干细胞不对称分裂中Miranda介导的细胞命运决定因子复合物的结构和功能研究

Asymmetric cell division is the way that stem cell balances self-renewal and differentiation, a mechanism related to tissue homeostasis and tumor genesis. Drosophila neuroblast is the model system for studying the mechanism of asymmetric cell division. During mitosis, cell fate determinants Prospero, Brat and Staufen are localized at the basal cortex through the scaffolding protein Miranda and segragated into the basal daughter cell, where they specify the GMC fate of the daughter cell. In this proposal, we plan to perform biochemical and structural.charaterizations of the cell fate determinants complex associated with Miranda, study the interactions between Miranda and each of the cell fate determinants, and solve the three-dimensional structures of the protein complexes. At the same time, we will study the biochemical and structural basis of the Flfl mediated regulation of Miranda localization during the mitosis. Based on the structural information obtained from the above studies, mutations will be designed to perform in vivo functional study to clarify the functional relationship between the three cell fate determinants, and reveal the molecular mechanisms underlying the cell fate determination during asymmetric cell division.

细胞不对称分裂是干细胞在自我更新和分化之间取得平衡的重要途径，这一机制与组织的稳定以及肿瘤的发生有密切关联。果蝇的成神经细胞是干细胞不对称分裂研究的典型体系，在分裂过程中细胞命运决定因子Prospero, Brat和Staufen由支架蛋白Miranda介导，定位于底部皮层，并随着胞质分裂不对称地进入底部子细胞，决定了底部子细胞分化成神经节母细胞的命运。本项目在前期工作基础上，对以Miranda为中心的细胞命运决定因子复合物进行详细的结构表征，研究各个细胞命运决定因子与支架蛋白Miranda相互作用的结构基础，了解不同命运决定因子之间功能的协同和关联性的分子机制，解析各个蛋白质复合物的三维结构。同时，对Flfl蛋白介导的Miranda在细胞皮层定位的详细机制进行结构表征。根据结构信息设计相应的功能实验，揭示细胞命运决定因子调控细胞分化和自我更新。

干细胞不对称分裂的精确调控是决定细胞增值和分化的关键环节，有众多蛋白质及其复合物参与该过程。其中多个被称作细胞命运决定因子的蛋白在分裂末期决定细胞的属性，这些细胞命运决定因子的精确定位依赖于它们与某些脚手架蛋白的结合。在本项目中，我们主要研究了果蝇成神经细胞中脚手架蛋白Miranda和细胞命运决定因子Brat, Pros及Staufen的相互作用，以及调控Miranda定位的Flfl与Miranda的相互作用和它们的结构基础。另外，还研究了与干细胞不对称分裂调控相关的另外两个蛋白质复合物LGN/Gα和4.1G/NuMA的相互作用结构基础。首先，在对Mira/Brat的研究中发现Brat与Mira结合需要二聚体形式的CC-NHL结构域串列，我们解析了CC结构域的晶体结构，并构建了结构域串列复合物的结构模型。在对Mira/Pros的研究中发现Pros只能与Mira的long isoform结合。Pros的结合区域是结构无序区域，以动态多位点的相互作用模式结合。虽然Brat, Pros及Staufen均与Mira的中心coiled coil结构域结合，但是结合位点互不重合，可以形成Mira/Brat/Pros/Staufen四元复合物，说明Mira能够同时定位这三个细胞命运决定因子。Flfl是蛋白磷酸酶PP4的亚基之一，能够结合Mira的N端，并且Flfl/Mira的相互作用对于Mira和其他细胞命运决定因子的胞内定位是必不可少的。研究发现Flfl通过N端的EVH1结构域与Mira的N端一小段序列结合，我们解析了Flfl-EVH1/Mira复合物。其中Mira以反向FxxP识别序列结合在EVH1表面，与CENP/Flfl的结合模式相似。Flfl对Mira及其结合蛋白的定位调控很可能是通过介导蛋白复合物的去磷酸化。在LGN/Gα相互作用的研究中，我们揭示了Gα家族蛋白对GoLoco基序的特异性识别机制，其中D229氨基酸是一个重要的别构调控位点。这一结果解释了不同的Gα家族蛋白与GoLoco基序结合时的显著差异。4.1G/NuMA的相互作用负责调控细胞分裂末期的纺锤体定向，而这个复合物中的两个蛋白的相互作用区域均为无序区域。我们发展了结合实验和计算方法的研究策略，详细表征了4.1G和NuMA之间的模糊（fuzzy）相互作用的分子机制，为研究无序蛋白相互作用开辟了新的道路。

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