热纤梭菌纤维糊精的代谢机理及代谢增强研究

The cellulosome is the most efficient extracellular supramolecular machine in the nature that can efficiently degrade cellulose. However, serious degraded production inhibition hampered its industrial application. The emphasis of this proposal focuses on the key bottleneck of employing cellulosome for emzymatic hydrolysis of cellulose by Consolidated Bioprocessing route. The research plan consists of three parts: the function of cellodextrins degradation enzymes, metabolic mechanism of intracellular cellodextrins and its metabolic boost. Firstly, 6 cellodextrins degradation enzymes from Clostridium thermocellum DSM 1313 will be heterologous expressed and purified, and then its properties will be analyzed, which will give clues to enzymes function and enzymes priority for cellodextrins degradation. Secondly, construct a serious of mutant strains with disruption of hydrolytic or phosphorolytic cleavage of cellodextrins, and then analyze properties of these mutant strains on metabolic, transcriptional and proteinic levels, which will shed light on intracellular functions of cellodextrins degradation enzymes and metabolic mechanism of cellodextrins. Finally, Clostridium thermocellum DSM 1313 will be genetically manipulated to boost its intracellular cellodextrins metabolism. This work will pave the way for reduction of production inhibition of cellulosome and industrial application of Clostridium thermocellum in CBP.

天然纤维小体是自然界中最高效的纤维素降解超分子机器，产物纤维糊精的严重抑制效应是阻碍其工业化应用的主要瓶颈之一。本项目围绕纤维糊精代谢酶的体外体内功能、胞内纤维糊精代谢机理及纤维糊精代谢增强三个方面依次开展研究。首先以热纤梭菌DSM1313菌株的3种ß-葡萄糖苷酶和3种纤维二糖/纤维糊精磷酸化酶这两类酶为对象，通过大肠杆菌进行异源表达，并进行纯化和酶学性质分析，初步解析纤维糊精代谢酶的体外功能及对纤维糊精降解的优先性；其次，对这两类酶进行体内单基因敲除和多基因敲除，通过对突变菌株的表型分析及代谢物水平、转录水平和蛋白质水平的多尺度研究，解析这两类酶的体内功能，并在此基础上阐明胞内纤维糊精代谢的分子机理；最后，通过对代谢关键酶进行启动子强化或敲入新的同工酶，增强胞内纤维糊精的代谢性能。本项目将为纤维小体酶的产物抑制作用的缓解以及热纤梭菌在木质纤维素CBP工艺中的应用奠定必要的理论基础。

木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物质资源，具有转化为生物质能源从而替代化石能源的巨大潜力，对化石能源的替代将有效减缓全球的碳排放及气温的升高，具有战略性意义。然而，木质纤维素固有的抗降解屏障阻碍了木质纤维素的解聚利用，酶解效率低仍是实现工业化应用亟待解决的关键瓶颈之一。热纤梭菌是自然界中最高效的纤维素降解菌之一，然而，纤维素降解产物纤维寡糖严重抑制了热线梭菌的纤维小体的酶活性，阻碍了木质纤维素的降解进程。本项目应用蛋白质表达纯化技术、热纤梭菌遗传改造技术、代谢物组学技术等，通过对热纤梭菌产生的纤维寡糖的代谢路径关键酶的体外、体内功能研究，并结合代谢物组学技术、转录及蛋白质技术，解析了热纤梭菌纤维寡糖代谢的主要代谢途径，最终获得了增强纤维寡糖代谢的重组菌株。本项目的主要研究成果有：（1）首次解析了热纤梭菌胞内β-葡萄糖苷酶(Bgl)同时具有降解纤维寡糖和昆布二糖的活性，且主要负责昆布二糖的胞内降解；（2）解析了热纤梭菌胞内纤维寡糖代谢的主要代谢途径为纤维二糖/纤维寡糖磷酸化酶途径；（3）最终获得了增强纤维二糖和纤维寡糖代谢的2株重组菌株；（4）从细胞及分子层面解析了耐热高活性的β-葡萄糖苷酶与热纤梭菌纤维小体体外、体内协同降解木质纤维素产糖的作用，两者协同作用可以实现将木质纤维素一步降解成为葡萄糖，且这种协同作用解除了纤维寡糖对纤维小体酶活性的抑制，提高了热纤梭菌对木质纤维素的降解效率。热纤梭菌重组菌株用于高效降解木质纤维素产糖的技术目前已获得中国科学院“变革性洁净能源关键技术与示范”战略性先导科技专项的支持，有望在未来4年内大力推动木质纤维素降解产糖的中试化进程。

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