依赖Na+的新型HCT家族转运蛋白SdmlT的功能鉴定及其重要氨基酸残基的功能分析

Preliminary experiments suggest that SdmlT may be a novel HCT family transporter with Na+(Li+)/H+ antiport activity, but its function hasn't been identified experimentally as yet. In this project, we plan to identify the exact function of SdmlT as a novel HCT family transporter by analyzing the uptake of 14C labeled 2-hydroxycarboxylate by RSO membrane vesicles or inverted membrane vesicles containing pUC-sdmlT. Also, we plan to identify whether SdmlT functions as a Na+(Li+)/H+ antiporter through the acridine orange fluorescence dequenching method based on inverted membrane vesicles or by analyzing the uptake of 22Na by inverted membrane vesicles containing pUC-sdmlT, and whether Na+(Li+)/H+ antiport by SdmlT needs to be coupled to the transportation of 2-hydroxycarboxylate. More importantly, we plan to analyze the structure-function relationship of SdmlT through site-directed mutagenesis of potential functionally important amino acid residues. As a novel HCT family transporter, identification of SdmlT and its functionally important amino acid residues will be very helpful to not only understand molecular mechanism of 2-hydroxycarboxylate transportation by SdmlT and halo-alkali tolerant molecular machnism of SdmlT, but also enhance our knowledge of the key role of HCT family transporter and Na+(Li+)/H+ antiporter in bacterial halo-alkali tolerance. Moreover, identification of functionally important amino acid residues may provide a theoretical basis for us to carry out gene-level modification of SdmlT based on site-directed mutagenesis to further enhance the capacity of halo-alkali tolerance.

前期研究暗示SdmlT是一个可能具有钠（锂）/氢逆向转运蛋白功能的新型HCT家族蛋白，但其确切功能仍然未定。因此，本项目拟采用基于RSO膜微囊或反转膜微囊的同位素14C标记的检测技术，鉴定SdmlT具体作为何种HCT家族蛋白行使功能；采用基于反转膜微囊的吖啶橙荧光猝灭恢复法或同位素22Na的检测技术，鉴定SdmlT是否具有钠（锂）/氢逆向转运蛋白功能，以及该功能是否与HCT家族蛋白功能偶联；在此基础上，通过定点突变方法着重对SdmlT的保守氨基酸残基进行功能分析，以确定其中负责转运2-羟基羧酸和钠、锂离子以及与pH值调控有关的重要残基。作为新型HCT家族蛋白，SdmlT的功能及其重要残基的鉴定，不仅可以揭示该蛋白转运2-羟基羧酸以及耐盐碱的分子机制，而且可以增进人们对HCT家族蛋白和钠（锂）/氢逆向转运蛋白在细菌耐盐碱方面的认识，同时指导我们对SdmlT的分子改造以进一步提高其耐盐碱能力。

前期研究暗示，SdmlT极可能是一个具有Na+/H+逆向转运蛋白功能的新型HCT家族蛋白。然而，其确切功能及其转运2-羟基羧酸和Na+的分子机制仍然未知。为了对SdmlT的准确功能进行鉴定，我们首先将SdmlT构建于表达载体pET19b，并转入大肠杆菌（E. coli）EP432（ΔnhaA, ΔnhaB）。耐盐碱测试以及AO荧光猝灭法的活性检测表明SdmlT具有Na+（Li+，K+）/H+逆向转运蛋白活性。Western blot检测显示，SdmlT定位于细胞质膜。系统发育分析发现，SdmlT代表一类新型的Na+（Li+，K+）/H+逆向转运蛋白。SdmlT与HCT家族同源物的序列比对显示，SdmlT应该最可能为一个CitS型Na+/苹果酸同向转运蛋白。为验证这一推断，我们首先采用Red同源重组构建了大肠杆菌（E. coli）K12的二羟基羧酸输出蛋白基因dctA的敲除突变株。互补实验表明，SdmlT为一个苹果酸摄取蛋白并且苹果酸的摄取依赖于Na+的存在。以含有枯草芽胞杆菌中已鉴定的Na+/苹果酸同向转运蛋白MaeN作为正对照，进一步的生长实验表明，苹果酸存在的情况下，SdmlT表现Na+/苹果酸同向转运蛋白功能；而在苹果酸不存在的情况下，SdmlT表现Na+/H+逆向转运蛋白活性。更重要的是，SdmlT只能通过独立独立行使Na+/H+逆向转运蛋白活性的方式输出Na+。在此基础上，我们对SdmlT与功能相关的重要氨基酸残基进行分析。依据同源性分析，并结合氨基酸残基在拓扑异构学二级结构和三维结构中的位置，最终我们确定了17个可能与功能相关的重要残基。基于定点突变以及生长互补实验，并结合预测的SdmlT三维结构模型，我们预测了SdmlT转运2-羟基羧酸和Na+、Li+的分子机制，即SdmlT蛋白可以采用共用部分的氨基酸残基（即同一Na+通道），外排Na+和向内摄取Na+，然而Na+向内转运方式不完全等同于Na+外排的可逆过程。本项目的创新性和科研价值在于，首次证实SdmlT是一个新型的HCT家族蛋白，同时也代表一类新型的Na+（Li+，K+）/H+逆向转运蛋白。更重要的是，首次报道了一个Na+转运蛋白可以根据不同的环境条件开启向外输出Na+或向内输入Na+的分子机制。

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