防御素3修饰牙周膜细胞片层修复犬牙周炎缺损的实验研究

Periodontitis is a bacterially induced chronic inflammatory disease that is the major cause for absorption of alveolar bone and eventual loss of teeth in the adult population. The newborn tissues are proneto be re-attacked in microbial and bacerial-rich environments such as petiodontitis.Defensins are a family of antimicrobial peptides and vital contributors to host immune response.Unlike other antimicrobial peptides, beta-defenisn-3 (BD-3) exhibits effective antibacterial ability in biological fluids.On the other hand, BD-3 has been shown to promote wound closure in infected diabetic wounds. In the present study, We aim to evaluate if BD-3 enginnered periodontal ligament cell sheet could reconstruct the physiological architecture of a periodontal ligament-cementum complex, inincluding cementum and the formation of new periodontal ligaments, as.well as Sharpey_s fibers attached to the new cementum-like layer, in beegle dogs with periodontally tissue defects, thereby providing a practical approach for the tissue regeneration of infectious diseases.

牙周炎是侵犯牙龈和牙周支持组织的慢性炎症性破坏性疾病，导致牙齿松动甚至脱落。由于牙周组织炎性环境的存在或加重，新生组织面临着被二次吸收破坏的危险。防御素具有高度的抗菌活性，是维持牙周健康重要的抗微生物肽之一。本课题拟以质粒为载体，以BD-3基因修饰犬PDLCs，检测其抗菌活性，并以此构建PDL细胞片层，自体回植修复犬实验牙周炎模型。通过大体观察、组织学、免疫荧光等技术手段，观察BD-3基因修饰牙周膜细胞片层修复牙周炎组织缺损后的愈合情况、牙周软硬组织生成情况，观察牙周重建并检测分化相关因子（BSP,OCN,S100A4,POSTN）的表达情况，研究新生牙周组织对炎性环境的反应，探讨BD-3修饰后的组织工程化牙周组织抗感染能力及其可能机制，为牙周炎组织缺损修复提供实验依据，为今后移植物术后抗感染提供参考，并为基因治疗牙周病提供新思路，对于临床应用具有重要意义和广泛前景。

牙周炎是由牙菌斑微生物所引起的慢性炎症性疾病，可引起牙周组织破坏，牙齿松动脱落。因此牙周治疗的最终目标是实现牙周组织的再生。 .目前临床上牙周治疗包括常规牙周洁治以及根面平整等手术治疗。这些方法都能在一定程度上减缓牙周炎的发展。但在炎症环境中，牙周组织往往会遭到二次破坏。因此，我们亟需找到一种抗菌物质并结合适当的方法能够应用于临床，帮助牙周组织再生，并使其能够免受炎症侵害。.防御素是一类抗菌肽， BD-3具有高度的抗菌活性。有研究发现，牙周炎患者的龈沟液中其含量显著下降。细胞片层技术一种新型无支架细胞传输技术，目前已在组织修复中广泛应用。抗菌肽基因治疗能够保护重建组织或器官免遭再次感染，并且能减少使用传统抗菌治疗带来的药物敏感或抵抗。..本课题分为体内和体外两部分。在体外实验中，我们将BD-3基因通过转染的方式修饰人牙周膜细胞及人骨髓基质细胞。通过GFP荧光标记确定转染效率后，检测其抗菌活性。结果显示转染细胞对牙周炎主要致病菌（牙龈卟啉单胞菌和黏放线菌）、龋病致病菌（变形链球菌）及口腔黏膜机会性致病菌（白色念珠菌及粘滑口腔球菌）均具有良好的抗菌作用，同时兼具成骨特性。我们进一步将BD-3基因转染至狗骨髓基质细胞，并构建细胞片层。通过western blotting及ELISA实验，发现细胞片层亦能分泌的足量的BD-3，且抗菌实验表明细胞片层具有类似的抗菌作用。在体外实验部分，我们首先建立犬牙周炎模型，自体回植细胞片层。经过8周实验周期后，通过大体观察、组织学、免疫组织化学等技术手段，观察BD-3基因修饰骨髓基质细胞片层修复牙周炎组织缺损后的愈合情况、牙周软硬组织新生情况，观察牙周炎性相关因子（TNF-α和 IL-lβ）及骨形成相关因子OCN的表达情况。研究发现BD-3基因修饰骨髓基质细胞片层回植后，牙周炎症改善并出现组织再生情况，牙周袋深度减少。组织学可见牙周膜炎性细胞浸润减少，牙周韧带纤维排列趋于规则分布，破骨细胞数目减少并可将新生骨小梁结构。免疫组化分析发现TNF-α和 IL-lβ表达明显减少，而OCN表达则显著增多，说明BD-3通过抗炎、中和毒素的作用，在炎性环境中缓解炎症进程从而促进成骨。..综上所述，我们通过本课题研究发现，BD-3转染的骨髓基质细胞片层能减轻炎症引起的骨吸收，可作为一种新型安全的方法应用于牙周重建治疗中。

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