血清中“不可见”小分子代谢物定量测定的NMR方法研究

Quantitative determination of small molecule metabolites in blood serum or blood plasma is crucial to the clinical disease diagnosis or health assessment. NMR spectral-editing techniques are powerfull tools for quantitative analysis of serum metabolites because these techniques can quantify the metabolites in serum without the need of pretreatment. But existing NMR methods cannot quantify metabolites which bind to serum proteins. Our preliminary studies have shown that by adding small molecule compounds which bind strongly with serum proteins, some serum metabolites NMR signal is greatly enhanced. This indicates that metabolites which bind to biological macromolecules in serum can be replaced by strong binding small molecule compounds by competitive binding, and therfore turn bonded metabolites into free metabolites and NMR "invisible" signals into "visible". These make the quantitative determination of metabolites which bind to serum protein possible. Using small molecule drugs as competitive binding ligands, the project would build a NMR model for quantitative detection of bonded serum metabolites. It is of great significance to the human disease diagnosis and health assessment.

血清或者血浆中小分子代谢物的含量测定是临床疾病诊断或健康水平评估的依据。NMR谱编辑技术无需对血清样品进行预处理就可以检测血清中代谢物的含量，是血清代谢物定量分析强有力的手段。但现有的NMR方法不能定量测定在血清中与蛋白质结合的代谢物。我们的初步研究表明，在血清中加入与血清蛋白质有强结合作用的小分子化合物，可使血清中某些代谢物信号大大增强。这就表明强结合小分子化合物可通过竞争结合原理置换出血清中与生物大分子结合的小分子代谢物，使结合态代谢物变成游离态代谢物，使其NMR信号由"不可见"变为"可见"，从而使与血清蛋白有结合作用的代谢物的定量测定成为可能。本项目拟以与血清蛋白有强结合作用的小分子药物作为竞争结合配体，建立测定血清中与蛋白结合的小分子代谢物含量的NMR方法，这对于血清代谢物的定量检测、人类疾病诊断及健康水平评估等均具有重大的意义。

血清或者血浆中小分子代谢物的含量测定是临床疾病诊断或健康水平评估的依据。但由于代谢多样性的存在，很难确定靶成分在血浆中的正常浓度范围。且许多代谢物在血清中通常以与蛋白结合的形式存在。但现有的NMR方法不能定量测定在血清中与蛋白质结合而“不可见”的的代谢物。因此，探讨小分子化合物与血清蛋白质的结合机理，研究血清的代谢多样性，构建血清中“不可见”小分子代谢物定量测定的NMR方法对于人类疾病诊断、个性化治疗及健康水平评估等均具有重大的意义。. 本项目采用NMR方法对70个血清样本研究了人类代谢多样性，结果表明NMR结合主成分分析（PCA）可用于定量表征人类血浆代谢多样性。同时，这一多样性还与药物布洛芬（IBP）引起的变化高度相关（P＜0.0001）。我们以IBP为竞争性强结合小分子化合物，分别采集加入IBP 前后血清样本的NMR谱，对加入IBP 后新增或明显增强的谱峰进行了信号归属、结构分析及含量测定，确定乳酸(lactate)、丙酮酸(pyruvate)、酪氨酸(tyrosine)、苯丙氨酸(phenylalanine)及组氨酸(histidine)为与血清蛋白有相互作用的小分子代谢物。大约2/3的乳酸以结合态形式存在于血清中，而丙酮酸则为40%，因此，乳酸与血清蛋白的相互作用强于丙酮酸。含量测定的结果表明，血清中的小分子代谢物浓度存在明显的个体差异。另外，我们分别采用分子对接及分子动力学模拟方法探讨了小分子化合物布洛芬（IBP）与血清蛋白质——人血清白蛋白（HSA）相互作用的机理、结合位点及结合能。结果表明HSA分子可与32个IBP分子形成稳定的复合物。IBP与HSA的IB、IIA、IIIA等结构亚域均有强的相互作用，这就解释了IBP对作用于除site 2以外结合中心药物的替代现象，也解释了HSA对IBP的多个结合中心，同时，通过对不同IBP分子对HSA的结合能分析，也揭示了药物蛋白相互作用的共结合现象。

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