EV71神经毒性靶点的鉴定及致病机理研究

EV71病毒感染可引起无菌脑膜炎、小脑脑炎及急性肌肉无力麻痹等神经系统并发症，其神经细胞毒性是引起婴幼儿重症手足口病死亡的重要病因，但其致病机理仍是个迷。本项目在EV71分子流行病学和生物信息学基础上，以高神经毒性EV71分离株为研究对象，利用反向遗传学技术平台，构建一组3Dpol 基因和IRES不同位点突变的EV71病毒，通过对神经细胞和非神经细胞的感染，在细胞水平检测不同突变株的复制特性，鉴定EV71 3Dpol与宿主细胞相互作用的靶蛋白及与神经毒性相关的蛋白，解析3Dpol 基因和IRES核苷酸突变与病毒毒力变化的相关性；利用动物感染实验，通过临床症状观察，病理切片，不同组织内病毒含量的定量检测，血液中细胞因子、免疫因子、炎症因子的定量测定，比较不同EV71变异株对宿主免疫系统的影响，揭示高神经毒性EV71导致病毒毒力增强的分子机理，为新型疫苗的研制提供理论依据和技术平台。

1．EV71 强神经毒性关键位点的鉴定.将具有不同临床症状的EV71的分离株脑内接种乳鼠，通过连续传代获得一组高致病性，强神经毒性的EV71分离株，在此基础上，通过空斑纯化获得一株强神经毒性的克隆株，命名为EV71 -9-6-1 MBP1。动物感染实验表明，EV71 9-6-1 MBP1能够从中枢神经系统广泛扩散至外周其他脏器，主要引起淋巴细胞浸润等炎症反应，与感染后期引起的高致死率紧密相关。通过蛋白质芯片和ELISA等方法证实EV71 -9-6-1 MBP1感染乳鼠脑组织中MCP-1和RANTES两种细胞因子表达水平的显著上升，与病毒致病性提高和炎症反应加剧呈正相关反应，通过基因组测序，比较EV71 -9-6-1 MBP1和亲本株的两个区域，既病毒多聚蛋白翻译相关的IRES和与病毒侵入相关的衣壳蛋白VP1、VP3区域。结果表明，在IRES区的二级结构区域Loop 4，两者序列存在较大差异，这一区域的主要功能是与被切割的宿主翻译起始因子eIF4G结合，竞争抑制宿主蛋白的翻译，而在VP1和VP3区域，我们发现多个氨基酸位点突变，如VP1的第43个位点由碱性赖氨酸（K）突变为中性蛋氨酸（M）。.2．EV71 强神经毒性与宿主天然免疫之间的相互关系.研究发现EV71 强神经毒性与宿主天然免疫之间有着密切的相关性，研究结果阐明了EV71 病毒调控宿主抗病毒免疫的一种新机制，即通过其2C蛋白作用于IKKβ的Ｎ端而抑制IKKβ的磷酸化，进而抑制NF-κB 的转录激活。同时发现宿主脑内高丰度分布的microRNA：hsa-miR-296-5p能通过结合EV71 基因组上的关键位点有效抑制EV71 的复制，阐明了EV71 可通过突变逃逸miRNA 的抑制的分子机制。.临床调查发现EV71感染重症人中常伴有博卡病毒的共感染，而博卡病毒 (HBoV) 主要感染婴幼儿，针对这一现象我们开展了HBOV和EV71共感染对EV71致病性的影响的研究。研究表明 HBoV NP1通过同IRF-3相互作用阻止IRF3与IFN启动子的结合阻断了IFN的生成，而HboV VP2能与RIG-I的负反馈调节因子RNF125结合并抑制RNF125介导的RIG-I的泛素化降解，从而导致IFN-b持续产生。本研究揭示了HBoV调控宿主免疫反应的两种新机制。

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