KLF4基因在MAPK信号通路中对绵羊毛色形成调控机制的研究

At present, chemical dyeing is still the main solution to achieve a multicoloured fur products, however, chemical dyes is a major threat to human health and environment. Thus, the production of natural fur materials with multicolor has become the priority of the dyeing industry. To clarify the mechanism of animal fur color formation has a great theoretical and practical significance. It has been shown that MAPK pathway is an important pathway for regulation of coat color. The transcription factor KLF4 in the downstream of the signaling pathway is involved in the formation of coat color and plays an important role in the differentiation and function of epithelial cells. The activation of G protein indirectly leads to the upregulation of KLF4, but the specific mechanism of KLF4 gene in coat color formation is not clear. In this study, in vivo, the sheep with different coat color were used as the animal model and in vitro, hair follicle stem cells and melanocytes were cultured and transfected with KLF4 silencing and overexpression adenovirus. The role of KLF4 gene in MAPK signaling pathway in sheep melanocytes was studied in the aspects of signal transduction and post-transcriptional regulation. And the completion of this project will provide a molecular basis of coat color regulation and build a framework for genetic manipulation of coat color in animals.

目前，化学染色仍是实现毛皮产品丰富色彩的主要手段，而化学染料对人类健康及生存环境带来巨大的安全隐患，因此，生产具有天然色泽的毛皮原料已成为人民对美好生活的迫切需求，阐明动物毛色形成机制具有重大理论和现实意义。研究表明，MAPK通路是毛色调控的重要通路，该信号通路下游中的转录因子KLF4参与毛色的形成，在上皮细胞分化以及功能方面发挥着至关重要的作用，G蛋白的激活间接导致KLF4的上调，但KLF4基因在毛色形成中的具体作用机制尚不明了。本项目拟以不同毛色的绵羊以及绵羊毛囊干细胞和黑色素细胞为研究对象，用分子生物学手段获得KLF4基因，在细胞中过表达及沉默KLF4，着重从信号转导、转录后调控等方面研究KLF4基因在绵羊黑色素细胞中MAPK信号通路中的作用，探讨KLF4与毛囊干细胞及黑色素细胞的关系，为阐明动物毛色形成的分子机制，进而实现人工调控动物毛色提供科学基础。

【背景】毛囊发育起始于胚胎发育中后期，KLF4对胚胎发育具有重要作用，其缺失可导致皮肤终末分化阶段障碍，导致小鼠出生后迅速死亡。因此，研究KLF4是否参与小鼠毛囊形成具有重要意义，而目前鲜有KLF4在毛囊发育过程中表达规律的研究报道。.【研究内容】1）利用分子生物学手段检测小鼠毛囊发育周期和毛囊周期KLF4基因及相关蛋白的表达情况；2）利用分子生物学手段检测不用毛色绵羊中KLF4基因及相关蛋白的表达情况；3）通过测序方法对过表达KLF4的黑色素细胞差异基因的筛选和验证分析，筛选出有可能参与毛色形成的基因并检测毛色形成途径中相关基因的表达；4）探究C57BL/6小鼠过表达KLF4后对其毛囊生长发育的影响，初步阐明KLF4信号级联反应机制及其在毛囊生长发育中的作用。.【结果及结论】（1）KLF4在毛囊发育和毛囊周期的不同阶段的均有表达，表明KLF4参与毛囊发育和毛囊的周期循环。.KLF4在皮肤中存在持续性表达，且在自然周期中，KLF4在退化期的表达量高于静止期和生长期。在同步化周期中发现，KLF4在毛囊的生长期同样具有调控作用。.小鼠黑色素细胞中过表达KLF4后，小鼠黑色素细胞MITF、TYR mRNA、蛋白的表达量显著增加，黑色素产量增多，细胞胞体增大，树突明显增多，说明KLF4具有促进细胞树突生成的作用。通过转录组测序，筛选出五个与色素生成相关的基因Kitl，E-cadherin，Col6a3，S100a6，S100a4。GO功能富集结果显示差异基因与囊泡靶向和囊泡融合相关。因而，GO结果分布暗示KLF4可能参与黑色素的转运过程。在KEGG富集结果中发现上调基因在“PI3K−Akt signaling pathway”富集，可能通过PI3K−Akt信号通路调控MITF的表达。.构建过表达KLF4的绵羊黑色素细胞后发现：过表达KLF4能促进黑色素的产生，通过阻滞细胞周期S期、增加早凋细胞数量进而抑制黑色素细胞的增殖，此外，过表达KLF4可抑制黑色素细胞的迁移。.通过探究C57BL/6小鼠过表达KLF4后对其毛囊生长发育的影响，发现KLF4在小鼠背部毛囊再生过程中下调了Wnt/β-catenin信号通路关键因子，并抑制了毛囊的生长发育。

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