海洋绿藻亚心形四爿藻淀粉磷酸化酶在淀粉合成过程中的作用途径探讨

Microalgal starch is an important feedstock for biomass energy production. Starch phosphorylase (SP) catalyzes the reversible addition of the glucosyl moiety of Glucose-1-phosphate (G-1-P) to the non-reducing end of an acceptor α-1, 4 glucan, releasing orthophosphate (Pi). It represents a new kind of starch synthesis pathway that is independent of the function of ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase). The marine green microalga Tetraselmis subcordiformis accumulates starch under nitrogen deprivation, which correlates well with the expression of SP. It suggests that SP might play a role in starch synthesis, but the pathway for this function remains unclear. In this proposal, the isoforms and subcellular localization of SP in T. subcordiformis are firstly characterized, followed by sequential separation, purification and biochemical characterization of chloroplast-resided SP. Then the enzymatic reaction dynamics of the SP towards varieties of glucan substrates are characterized to reveal its substrate selectivity in both glucan elongation and phospholysis directions. Further, the influences of Pi and G-1-P concentrations on the reaction direction catalyzed by the SP are explored. The possible substrates for the SP as well as the catalytic reaction direction will be opened out, based on which the putative pathway of SP involved in starch synthesis could be disclosed. This project will provide novel insights into microalgal starch metabolism for the optimization of starch accumulation process on cellular and molecular level and enhance microalgal starch production.

微藻淀粉是制备生物质能源的重要原料。淀粉磷酸化酶（SP）可逆催化葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）的糖基添加到α-1, 4葡聚糖链的非还原端并释放正磷酸盐（Pi），代表了一类新的不依赖于ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）介导的淀粉合成途径。海洋绿藻亚心形四爿藻在缺氮下积累淀粉的模式与SP表达量正相关，提示SP可能参与其淀粉合成，但其作用途径并不清楚。本项目以产淀粉海洋绿藻亚心形四爿藻为材料，在确定亚心形四爿藻SP的亚型和亚细胞定位的基础上，分离、纯化和表征其中定位于叶绿体的SP，考察其对不同底物的酶反应动力学特征，揭示其催化糖链延长反应和磷酸化降解反应的底物选择性，探究Pi和G-1-P对亚心形四爿藻叶绿体SP催化反应方向的影响，揭示淀粉积累过程中细胞内SP可能的作用底物和方向，推测SP在淀粉合成过程中可能的作用途径，从而为在细胞和分子水平上优化淀粉积累过程、提高微藻淀粉产量提供理论依据。

微藻淀粉可以作为粮食作物的替代，在农业、食品、能源等领域有潜在的应用。目前公认的植物和微藻淀粉合成方式是基于ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）的合成途径，淀粉磷酸化酶（SP）被认为主要在淀粉的磷酸化降解中发挥作用。本项目以产淀粉海洋绿藻亚心形四爿藻为材料，研究了其淀粉磷酸化酶的亚型分布以及其中可能定位于叶绿体的亚型TsSP4的酶学性质和其活性随着淀粉积累过程变化的规律，揭示了亚心形四爿藻淀粉积累过程中TsSP4可能的作用底物和方向及其在淀粉合成过程中可能的作用途径。结果显示，亚心形四爿藻中有4个淀粉磷酸化酶亚型，其中TsSP4活性最高，分子量110 KDa，以单体的形式发挥功能，与已知的高等植物和藻类SP不同。TsSP4与定位于叶绿体的莱茵衣藻SP（PhoA）序列相似度高达63.3%，且具有定位于质体的高等植物SP（Pho1）的特征区域L70/L80，推测其可能也定位于叶绿体。TsSP4对合成方向底物葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）的亲和力和催化效率均是降解方向底物磷酸（Pi）的2倍，证明其在热力学上更具有延长糖链的倾向。在高浓度Pi（10 mM）存在的条件下TsSP4总体上催化麦芽五糖进行糖链延长方向的合成反应。TsSP4对短链（聚合度DP>4）的麦芽寡糖和分支较多的支链淀粉的选择性较高，说明其对淀粉合成的作用途径可能在于延长短链麦芽寡糖，为下游酶（如分支酶、可溶性淀粉合成酶等）提供合适糖链长度的底物，或者直接参与支链淀粉的糖链延长。TsSP4的活性与亚心形四爿藻淀粉积累在中后期呈正相关，表明其可能在淀粉合成的成熟阶段发挥重要作用。这些结果打破了传统上人们对于淀粉合成只依赖于AGPase催化的合成途径的认识，建立了微藻中基于SP的淀粉合成新途径。这有利于完善微藻淀粉代谢途径的分子机理，为从细胞和分子水平上优化淀粉积累过程、提高微藻淀粉产量提供了重要的理论依据。

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