龟鹿二仙胶抑制p16INK4a-Rb通路减轻化疗后骨髓造血干细胞衰老的机制研究

Myelosuppression is the main limiting toxicity of chemotherapy and affects patient survival. Hematopoietic stem cell senescence is the main mechanism of myelosuppression, and the p16Ink4a-Rb signaling pathway is the key to hematopoietic stem cell senescence. Previous studies by our research group have shown, guilu erxian glue can reduce bone marrow suppression after chemotherapy by resisting the senescence of bone marrow hematopoietic stem cells,also can significantly reduce the expression of p16Ink4a after chemotherapy, but the intervention of p53 inhibitor can not significantly reverse the bone marrow suppression. So we make a hypotheses, guilu erxian glue can reduce chemotherapy induced bone marrow hematopoietic stem cell aging by inhibiting p16INK4a-Rb signaling pathway. We will establish a model of hematopoietic stem cell senescence after chemotherapy,.Guilu erxian glue will apply to the model rat in vivo,use drug-containing serum and over-express p16Ink4a gene in vitro，to clarify the role of guilu erxian glue in reducing chemotherapy induced bone marrow hematopoietic stem cell aging. Detect protein and mRNA expression in the p16 Ink4a-Rb signaling pathway,to deep study the molecular mechanism of guilu erxian glue in reducing chemotherapy induced bone marrow hematopoietic stem cell aging, which can provide a new target for the Chinese medicine treatment of bone marrow suppression after chemotherapy.

骨髓抑制是化疗的主要限制毒性，影响患者生存。造血干细胞衰老是骨髓抑制的主要机制, p16Ink4a-Rb信号通路是造血干细胞衰老的关键。课题组前期工作显示，龟鹿二仙胶可能通过抵抗骨髓造血干细胞的衰老来减轻化疗后的骨髓抑制，可以明显减少化疗后p16Ink4a的表达，但是单纯p53抑制剂干预并不能明显的逆转骨髓抑制。因此我们提出假说：龟鹿二仙胶通过抑制p16Ink4a-Rb通路来减轻化疗后骨髓造血干细胞衰老。我们将建立化疗后造血干细胞衰老动物模型，将龟鹿二仙胶作用于该模型大鼠进行体内研究，运用含药血清及过表达p16Ink4a基因进行体外细胞实验，从而明确龟鹿二仙胶减轻骨髓造血干细胞衰老的作用；进行p16 Ink4a-Rb信号通路上各蛋白及mRNA表达的检测，来深研究龟鹿二仙胶治疗化疗后骨髓造血干细胞衰老可能的分子机制，为中医药治疗化疗后骨髓抑制提供新的靶点。

化疗是治疗各种恶性肿瘤的主要手段之一，其疗效确切，但约90%以上的化疗药物都会不同程度地造成骨髓抑制，影响患者的生存质量，甚至死亡。造血干细胞衰老是化疗后骨髓抑制的主要机制，而p16Ink4a -Rb 信号通路是造血干细胞（HSCs）衰老的关键。龟鹿二仙胶（GEG）是临床治疗化疗后骨髓抑制的有效方剂，前期已发现GEG可能通过抵抗骨髓HSCs 的衰老来减轻化疗后的骨髓抑制；GEG可以明显减少化疗后 p16Ink4a的表达，但是单纯的p53抑制剂干预并不能明显的逆转骨髓抑制；提示GEG可能通过抑制p16Ink4a -Rb 通路减轻化疗后骨髓HSCs衰老，从而减轻化疗后骨髓抑制。但深入的分子机制尚需进一步揭示。.基于此，本项目开展了不同剂量顺铂对荷瘤小鼠血液学及骨髓HSCs的影响，发现4 mg/kg/2d和7.5 mg/kg/week顺铂干预均能导致介导荷瘤小鼠骨髓HSCs损伤及衰老，其中4 mg/kg/2d可致小鼠死亡，7.5 mg/kg/week可导致免疫器官胸腺及脾脏萎缩；GEG能改善不同剂量顺铂造成的血细胞异常，减轻顺铂对免疫器官的损伤。整体动物实验发现，顺铂可将骨髓HSCs阻滞在G2+M期前，介导骨髓HSCs衰老；予以GEG治疗，能有效抑制体内H22肿瘤细胞生长，增强骨髓HSCs活性，减少顺铂介导的G2-M周期阻滞，下调p16-Rb通路p16、H3K36me2、H3K36me3表达，上调下游JMJD2、CDK4、CDK6、pRb蛋白表达，拮抗顺铂介导的骨髓HSCs衰老，改善荷瘤小鼠骨髓抑制。体外细胞实验结果表明，GEG含药血清能拮抗顺铂诱导的骨髓HSCs衰老，该作用可能与抑制p16表达，促进组蛋白H3K36去甲基化有关。基于shRNA、Chip技术的作用机制研究进一步证实，GEG通过上调JMJD2引起H3K36去甲基化抑制p16Ink4a表达，减轻顺铂介导的骨髓 HSCs衰老和骨髓抑制。.项目研究揭示了龟鹿二仙胶防治化疗后骨髓抑制的分子机制，有助于促进龟鹿二仙胶在防治化疗诱导的骨髓抑制中的应用，为中药与化疗药物联用增效减毒抗肿瘤研究提供思路借鉴。

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