安全性慢病毒载体介导的β-地中海贫血基因治疗研究

β-thalassemia is a common inherited blood disorder. It is also the disease best fit for gene therapy. Lentiviral vector is recently one of the most often used vectors in gene therapy. Though the clinical trial for treating severe β-thalassemia mediated by lentiviral vector has been successfully conducted, it was simultaneously raised a problem for the formation of the transduced cell clones after the cell amplification, which poses a potential bio-safety risk. Thus, how to organize a bio-safe and effective β-thalassemia gene therapy protocol is the key for the success of the trial. In this proposal, we aim to apply our recent achievements on improving lentiviral vector bio-safety by introducing self-deletion viral backbone mechanism in chromosome at the meantime of reducing its transcriptional read-through in our β-thalassemia gene therapy study, using patient cells and model mice. Upon the assessment of bio-safety and treating efficacy by analyzing the transgene expression efficiency, the improvement of β-thalassemia phenotypes, the potential risk for the vector flanking sites, and their read-through rates in situ, etc, we wish the outcomes would pave a way for a safe and effective clinical application.

β地中海贫血(β-地贫）是常见的遗传性血液病，也是基因治疗的最佳候选疾病之一，而慢病毒载体（LVV）则是基因治疗中被运用最多的载体之一。近年来，以LVV介导的对β-地贫的基因治疗虽然取得了效果，但同时也引发了细胞的克隆化扩增现象，从而存在着潜在的安全性隐患。因此，如何组织实施既安全又有效的β-地贫基因治疗的方案是该研究成功与否的关键。本课题拟将近年来我们在改进LVV的安全性研究方面所取得的科研成果，即在LVV整合入染色体后，进一步自删除其慢病毒元件，以及降低LVV转录通读率的科研成果，与本所多年来在β-地贫基因治疗研究的成功经验相结合，用经安全性改进的LVV介导β-珠蛋白基因等在β-地贫的细胞和模型小鼠中进行基因治疗的研究。从外源基因的表达、贫血症状的改善程度以及载体的位点整合信息等多方位、多角度地进行安全性和有效性的深入评估，从而为β-地贫基因治疗的临床应用提供理论和应用依据。

本研究的目的，是基于我们小组前期改善慢病毒载体（LVV）安全性的研究成果的基础上，针对LVV在基因与细胞治疗中所存在的安全隐患，打造在红系更充分表达β-珠蛋白基因，更安全的，国际领先的LVV。首先，我们对各降低LVV的转录通读元件进行了系统的研究。我们共设计了10套有可能降低转录通读的元件组合，通过一系列的研究，在各细胞系，分别使用各种不同的载体系统，即模拟pro-LVV在染色体上的质粒系统或转导LVV病毒后经整合入染色体以后，在RNA和蛋白水平各个不同的层面上分别检测其转录通读率。我们最终筛选出2种原创的、最有效降低LVV转录通读的方案，即C-U和F。本项目作为第一资助项目，将本研究成果及其生化特征已被发表在2019年5月的The Journal of Gene Medicine杂志上。在此基础上，我们还融合了以上两个研究成果，构建了自删除、低通读率的红系特异表达β-珠蛋白基因的LVV。并且以β-地贫模型小鼠作为受体小鼠，制备了转基因小鼠。我们认为β-地贫基因治疗的成功与否的关键之一，是需要有既红系特异地高效表达，又安全可靠的表达载体的支撑。为此我们重新构建了BB305作为对照载体。在验证和比较该载体过程中，我们认为我们有必要并且也有能力打造比BB305更加安全有效的LVV。为此，我们首先设计了各种组合的嵌合体启动子，来驱动置于β-珠蛋白基因座内的GFP基因的表达。经转染K562等细胞以后，通过流式细胞术筛选出了最强表达GFP的启动子组合。将此质粒进一步转染入小鼠胎肝细胞以后，经Ter119抗体标记后，用磁珠法分离该群体细胞。通过流式细胞术检测，并且与Ter119抗体标记阴性细胞相比较，证实了该启动子与β-珠蛋白基因启动子具有相似的红系特异性。至此，我们初步获得了表达强度高于BB305的嵌合体红系特异表达的强启动子。与此同时，我们还在K562等细胞检测了BB305的转录通读率。当我们在其下游插入由我们研发的降低转录通读的元件C-U时，则其转录通读率得到了有效的降低。相关研究成果正打算被用于申请新的国家自然科学基金项目的研究基础。至此，在本项目的研究中，我们取得了以下的的研究成果：.1）完整地描述了2个原创的更加有效地降低LVV转录通读的元件及其相关的生理特征。.2）初步打造了比BB305更加安全有效的，国际领先的LVV。

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