基于Transwell系统研究奶牛乳腺上皮细胞小肽摄取的分子机制

The mammary gland needs a large amount of amino acids for milk protein synthesis during lactation of dairy cows. However, free amino acids uptake by the mammary gland cannot fully meet the needs of milk protein synthesis. In order to satisfy the deficiency of free amino acids and maintain the balance of nitrogen and carbon uptake and excretion, mammary gland must absorb non-free amino acids, i.e. small peptides, as precursors of protein synthesis. However, the transport mechanism of small peptides in the mammary gland are still unclear. Therefore, the transport mechanism of small peptides in bovine mammary epithelial cells (BMECs) cultured in transwell chambers will be studied. The following studies will be carried out in this project. Firstly, the transport way of blood small peptides into BMECs will be detected; Secondly, uptake directional differences of small peptides by BMECs layer and the role of small peptide transporters in different small peptides uptake directions will be studied; Thirdly, effect of gene silencing of BMECs basement membrane small peptide hydrolase on small peptide uptake will be investigated. This study is helpful to reveal the cellular and molecular mechanism of small peptide uptake by mammary gland, clarify the role of small peptides in the metabolism of mammary protein in dairy cows, and provide theoretical basis for directional regulation of milk protein synthesis.

奶牛泌乳期间，乳腺需要大量的氨基酸用于乳蛋白合成。然而乳腺摄取的游离氨基酸并不能完全满足乳蛋白合成的需要。为了满足游离氨基酸的不足、保持氮和碳的摄取和排出平衡，乳腺必须摄取非游离态的氨基酸，即小肽作为蛋白质合成的前体物质。但是，奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）摄取利用小肽的分子机制仍不清楚。鉴于此，本课题拟将BMECs接种于Transwell中间滤网进行极化培养，检测BMECs摄取血液小肽的方式；研究BMECs细胞层对Transwell上室和下室小肽摄取的方向性差异，以及小肽转运载体在BMECs不同方向小肽摄取中的作用；探讨BMECs基底膜小肽水解酶基因沉默对小肽摄取的影响，揭示小肽进入BMECs的形式。该研究有利于揭示乳腺摄取血液小肽的分子机制，为明确小肽在奶牛乳腺蛋白质代谢中的作用，定向调控乳成分提供理论依据。

奶牛泌乳期间，乳腺需要大量的氨基酸用于乳蛋白合成。然而乳腺摄取的游离氨基酸并不能完全满足乳蛋白合成的需要。为了满足游离氨基酸的不足、保持氮和碳的摄取和排出平衡，乳腺必须摄取非游离态的氨基酸，即小肽作为蛋白质合成的前体物质。但是，奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）摄取利用小肽的分子机制仍不清楚。鉴于此，本项目将BMECs接种于Transwell中间滤网进行极化培养，检测了BMECs摄取血液小肽的方式；研究了BMECs细胞层对Transwell上室和下室小肽摄取的方向性差异，以及小肽转运载体在BMECs不同方向小肽摄取中的作用；探讨了BMECs基底膜小肽水解酶基因沉默对小肽摄取的影响，揭示小肽进入BMECs的形式。研究结果表明：BMECs接种于Transwell滤网培养约5天时细胞层跨膜电阻达到平台期，FITC-Dextran渗透率显著低于对照组，说明细胞层紧密性良好，渗透作用很小，成功建立了细胞屏障，可用于跨膜转运试验；BMECs摄取血液小肽的主要方式为主动运输；Transwell上室和下室小肽均可被BMECs吸收用于乳蛋白的合成，且其对上下室小肽的摄取具有差异性，PepT2在上室和下室小肽摄取中发挥重要作用，PhT1可能参与了下室小肽的摄取；BMECs基底膜小肽水解酶MBD1基因沉默降低了小肽的吸收，APN基因沉默则显著降低了小肽的摄取和乳蛋白的合成。以上结果提示，BMECs摄取小肽的主要方式为需要转运载体的主动运输，PepT2在BMECs底膜小肽完整摄取过程中发挥重要作用，小肽水解酶APN在水解小肽为氨基酸后摄取过程中亦发挥重要作用。该研究揭示了乳腺摄取血液小肽的分子机制，明确了小肽在奶牛乳腺蛋白质代谢中的作用，为定向调控乳成分提供了理论依据。

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