他替瑞林诱导γ-氨基丁酸神经元表达酪氨酸羟化酶发挥抗PD作用的分子机制研究

We found that taltirelin (TAL) could significantly increase dopamine levels in the brain of PD rat, continuously improve its motor function, and induce the expression of Tyrosine hydroxylase (TH) in striatal gamma-aminobutyric acid neurons. However, its anti-PD effect and underlying mechanisms are unknown. Based on the existing evidences, we speculated that TAL could bind with TRH receptor on striatal gamma-aminobutyric acid neurons, activating PKC, which on one hand regulates the expression and activity of the transcription factors to promote TH transcription; on the other hand, increase TH phosphorylation to increase its catalytic activity, so as to participate in DA synthesis. In this project, we will certify this conjecture in vivo and in vitro through knocking out TRH-R1 or TRH-R2, knocking down or over-expressing related genes, activating or inhibiting kinase activity. These results will provide theoretical basis for the clinical application of TAL.

我们在前期研究中发现，促甲状腺激素释放激素类似物他替瑞林（Taltirelin, TAL）能够显著增加帕金森病（PD）大鼠脑内多巴胺含量、持续改善其运动功能，且可诱导纹状体γ-氨基丁酸神经元表达酪氨酸羟化酶（TH）。TAL通过TRH受体发挥作用，但介导其发挥抗PD作用的受体亚型及具体分子机制不详。基于现有证据我们推测：TAL与γ-氨基丁酸神经元上的TRH受体结合后，激活PKC等相关激酶，一方面激活转录因子CREB和hnRNP K，促进TH转录，另一方面对TH磷酸化修饰、增加其催化活性，从而促进多巴胺合成。本项目将通过敲除相关受体亚型、上调或下调相关基因、激活或抑制相关激酶活性等手段，运用在体电生理、微透析、高效液相色谱、荧光素酶报告基因、凝胶迁移等技术，从体外与在体水平对上述假说进行验证，为TAL的临床应用提供理论依据。

他替瑞林（Taltirelin）作为一种口服有效的促甲状腺激素释放激素（TRH）类似物，具有比TRH强10-100倍的中枢神经系统(CNS)刺激活性和8倍长的持续时间，相关实验研究发现他替瑞林在帕金森病（Parkinson’s disease,PD）动物模型中显著改善了PD大鼠的运动功能，并促进纹状体中多巴胺（DA）温和而持久的释放，然而其具体分子机制并不明确，限制了他替瑞林在PD临床的应用。本项目前期研究通过6-OHDA诱导的PD大鼠模型纹状体的转录组学、蛋白组学分析，发现促甲状腺激素释放激素受体（TRHR）在PD大鼠模型纹状体中表达减少，并且他替瑞林主要通过神经受体配体相互作用、钙离子信号、MAPK信号通路发挥作用，同时他替瑞林引起的蛋白表达差异主要集中于轴突、染色体以及核膜等位置。通过后续研究，我们证明他替瑞林能够引起TRHR的表达增多，同时增多的TRHR与合成多巴胺的关键酶TH共同在GABA能神经元细胞中表达，为他替瑞林通过TRHR受体信号发挥作用并且诱导纹状体GABA神经元产生多巴胺提供了证据。进一步研究我们发现TRHR增多同时引起多巴胺2型受体（DRD2）的表达增多，以及DRD2转录因子维甲酸受体α（RARα）的表达增多。已有研究证明帕金森病人长期应用多巴胺受体激动剂会使DRD2表达和效用减少，因此在后期研究中，我们在 SH-SY5Y 细胞中验证了他替瑞林对于TRHR的相应改变以及相关信号通路，并构建了敲除TRHR和过表达TRHR的细胞模型。上述结果确定了他替瑞林刺激TH表达增多的同时，刺激了TRHR的表达增多，并通过MAPK通路刺激了转录因子RARα的表达增多，继而引起了DRD2的表达增多，即发现了TAL-TRHR-MAPK-RARα-DRD2这一信号通路。综上所诉，本项目工作的研究结果为他替瑞林发挥抗PD作用提供了支持证据，为他替瑞林与多巴胺受体激动剂的合用提供了理论基础，并阐明了其信号机制，为临床PD药物应用提供了新的思路和策略。

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