菊苣无抗生素标记的叶绿体转化体系建立及耐盐新品系选育

扩大受体植物种类及非抗生素选择标记应用是叶绿体基因工程发展亟待解决的问题。本研究选用我国西部干旱地区广泛种植的牧草菊苣为试验材料，在已建立其叶盘高频再生体系的基础上开展叶绿体遗传转化研究。以菠菜的甜菜碱醛脱氢酶基因BADH作为替代抗生素的安全选择标记，构建叶绿体定点整合表达载体，进而用基因枪轰击法转化菊苣，并对转化条件和轰击参数进行优化，以期建立高效、稳定的菊苣叶绿体转化和无抗生素筛选体系。该研究不仅拓宽叶绿体遗传转化的受体植物种类，而且为通过叶绿体基因工程手段将更多感兴趣的基因导入菊苣进行遗传改良，或以菊苣叶绿体作生物反应器生产动物口服疫苗、医用蛋白等搭建技术平台；同时安全标记基因BADH在叶绿体中的高效表达可以提高受体植物体内甜菜碱的积累水平，有望使菊苣的抗旱、耐盐能力大幅提高，这将为西部地区大面积干旱、盐碱地的有效开发利用带来契机。

本项目以菊苣无菌苗叶片为外植体，建立了高效不定芽直接发生及其植株再生体系，并通过在培养基中添加不同浓度的甘露糖或壮观霉素，进行了两种筛选剂对菊苣外植体的敏感性试验，确定了合适的选择压力；通过PCR方法克隆了菊苣叶绿体基因组同源片段、菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因BADH、大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因PMI，以绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因，分别以抗生素抗性基因aadA或安全筛选标记基因PMI为筛选标记，构建了4个嵌合有BADH基因的菊苣叶绿体定点整合表达载体；探讨并优化了影响菊苣基因枪轰击转化的各种因素，建立了适合菊苣叶绿体转化的基因枪轰击程序及筛选体系；上述载体通过基因枪轰击法对菊苣进行转化，分别获得具有壮观霉素抗性和甘露糖抗性的抗性植株；PCR、Southern blot分析显示外源基因确实已整合进菊苣叶绿体基因组而非核基因组，RT-PCR分析外源基因在转基因植株中转录正常，激光共聚焦检测gfp在转基因植株叶绿体中成功表达，氯酚红法检测PMI酶活性，表明PMI可以作为安全选择标记替代传统的叶绿体转化的抗生素标记基因aadA；抗性小苗经多次抗性筛选，分子检测证实转基因植株实现了同质化；将转基因株系进行了生根、炼苗和盆栽，以未转化的植株为对照，对转基因植株分别进行人工模拟的干旱、盐胁迫处理，通过对生长状况、株高、鲜重的统计观察及多个生理生化指标的测定，证实在菊苣叶绿体基因组中表达了BADH基因，其抗旱、耐盐能力都有大幅提高。该研究首次建立了牧草菊苣的抗生素及非抗生素叶绿体遗传转化与筛选体系，获得抗性植株，不仅拓宽叶绿体遗传转化的受体植物种类，而且为通过叶绿体基因工程手段将更多感兴趣的基因导入菊苣进行遗传改良，或以菊苣叶绿体作生物反应器生产动物口服疫苗、医用蛋白等搭建技术平台，同时安全标记基因BADH在叶绿体中的高效表达提高了菊苣的抗旱、耐盐能力。

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