α-8 giardin骨架蛋白在蓝氏贾第鞭毛虫早期脱囊虫体中的生物学功能研究

Alpha（α）-8 giardin, one of the unique cytoskeletal proteins in Giardia lamblia, has strong function linking with the proliferation, movement, and virulence of this parasite. Since the special location, which is on the plasma membrane and the flagella of Giardia trophozoites, it is estimated to be involved in cytoskeletal rearrangements as annexin-like proteins of the Giardia early excysting cells as well, and plays roles of supporting protein and lectin. In this study, on the basis of our successful study on the intracellular localization of α-8 giardin in the trophozoites to further observe its intracellular localizations both in the trophozoites and the early excysting cells by immunofluorescence approach. Meanwhile, the observation of the relationship between the α-8 giardin and F-actin will be conducted；Techniques, including gene cloning, fusion protein expression, GST-pull down analysis and co-immunoprecipitation will be used to test the roles of cytoskeletal rearrangement and support protein in the Giardia early excysting cells；Heparin binding assay, sugar competition assay, western blot assay and small intestinal immuno histochemical method will be employed to detect the lectin role early excysting cells.The results of this study will provide a deeper understanding and valuable experimental data to the biological function study of α-8 giardin.

α-8贾第素(α-8 giardin)是贾第虫特殊的细胞骨架蛋白成分，参与虫体的增殖、运动，并与致病力密切相关。因其定位于滋养体细胞膜和鞭毛部位，推测其可能具有"annexin样蛋白"功能参与早期脱囊虫体细胞骨架重排，并具有支持性蛋白和凝集素的功能，但截止目前尚缺乏详尽的研究资料予以证实。本课题拟在前期对α-8 giardin在滋养体定位研究的基础上，应用免疫荧光双定位技术观察其作为annexin样蛋白在滋养体及早期脱囊虫体内与细胞骨架蛋白F-actin的细胞定位关系；采用重组蛋白、膜磷脂结合实验、GST-pull down、免疫共沉淀等技术，观测其作为支持性蛋白及annexin样蛋白与膜磷脂分子的相互作用；应用肝素结合实验、糖竞争抑制实验，western blot及小肠粘膜免疫组化等方法验证其凝集素作用。研究结果将为更深入了解α-8 giardin蛋白的生物学功能提供有价值的研究资料。

背景及主要内容.α-8贾第素(α-8giardin)是贾第虫特殊的细胞骨架蛋白成分与致病力密切相关，其在贾第虫生活史不同阶段虫体内的细胞定位和功能尚不清楚。本课题在前期成功对α-8giardin在贾第虫滋养体细胞内定位研究的基础上，应用免疫荧光定位技术观察α-8giardin在虫体不同发育阶段细胞定位变化，验证了α-8giardin蛋白的在虫体生活史不同阶段参与了细胞骨架重排等功能演变过程；同时，采用膜磷脂结合实验、生物信息学三维立体结构分析等技术，观测其与膜磷脂分子的相互作用，验证其作为“钙依赖性膜磷脂结合蛋白”的作用，进一步揭示了其在虫体脱囊后参与了膜-细胞骨架的重排；再次，应用免疫电镜、western blot等技术验证其作为“支持性蛋白”分布在早期脱囊虫体背部的胞膜下以及参与早期脱囊虫体在小肠粘膜表面的粘附功能发挥“凝集素”类作用。本研究结果为原始真核细胞生物细胞骨架蛋白的深入研究增添新的知识，为贾第虫致病机制的研究提供有价值的实验资料。.重要结果.按项目计划完成了贾第虫C2株及早期脱囊虫体的纯培养；成功制备了α-8giardin特异性单克隆抗体，应用免疫荧光技术完成了滋养体细胞及早期脱囊虫体内的α-8giardin定位比对及虫体发育过程中该蛋白的定位变化；通过α-8giardin蛋白原核表达，获得重组蛋白并通过膜磷脂结合实验及生物信息学3D结构分析，证实了α-8giardin在早期脱囊虫体内“annexin样蛋白”作用；应用免疫电镜技术观察，α-8giardin在早期脱囊虫体内，主要分布在虫体的形态的凸出面-虫体背部的细胞膜下，证明其具有“支持性蛋白”作用；同时，初步证实其具有类似凝集素的功能，参与早期脱囊虫体在小肠粘膜表面的粘附功能，是虫体重要的保护机制。此研究为真核生物细胞骨架系统的研究增添新的知识、为贾第虫致病机制的研究提供有价值的实验资料。. 本项目完成过程中，共培养硕士研究生3人，年轻检验师2人。课题组成员获得：甘肃省省青年科技基金计划项目1项，甘肃省卫生行业科研计划项目1项，甘肃省卫生行业科研计划管理项目1 项。发表期刊论8篇，其中SCI收录2篇，撰写英文稿待投稿2篇。

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