水稻抗稻瘟病主效QTL的精细定位和克隆

'Tianjinyeshengdao' (TY) is a local rice cultivar with durable resistance to the rice blast fungus Magnaporthe oryzae in China. To understand the genetic basis of its resistance to blast, we developed a population of recombinant inbred lines from a cross between TY and the highly susceptible CO39 for gene mapping and quantitative trait loci analysis. The major resistance gene Pi2-1 from TY was mapped on chromosome 6, and is linked to the markers AP5659-5 and RM7213 in an interval of 2.3cM. Large F2 populations from a cross between selected RILs carrying the markers linked to the Pi2-1 gene and the highly susceptible CO39 will be developed for gene fine-mapping in this study. Using a modified PCR enrichment screening strategy we will identify positive BAC clones from the TY BAC library, obtain positive BAC clones to construct BAC contigs that cover the Pi2-1 region. The candidate genes will be cloned into the pHZAUBAC1 vector using enzyme digestion or Long-range PCR. The cloned candidate genes will be transformed into the highly susceptible Nipponbare or other varieties by agrobacterium-mediated transformation. Gene structure and expression pattern of Pi2-1 will be analyzed using RACE-PCR and RT-PCR.

前期研究利用具有广谱稳定抗瘟性的地方品种天津野生稻（TY）与高感病品种CO39杂交，经多代自交构建的F7重组自交系群体对TY中的抗病基因进行QTL定位，将其中一个主效QTL Pi2-1基因初步定位在第6号染色体SSR标记AP5659-5到RM7213之间，两个标记之间的距离为2.3cM。本项目用含主效QTL Pi2-1基因的单基因系与高感病品种CO39杂交建立F2群体，对Pi2-1基因进行精细定位，绘制连锁图谱，并对候选基因进行预测；采用改良的PCR"富集"筛选法，从TY基因组BAC文库中，筛选完全覆盖Pi2-1基因区域的BAC单克隆并构建重叠群；利用酶切方法或Long-range PCR法将目标基因克隆到载体上，并通过农杆菌介导法，将候选基因转入日本晴等高感病品种中进行功能验证；通过RACE-PCR技术和RT-PCR技术，分析基因结构和表达模式特征。

水稻是一种重要的单子叶作物，是全世界最重要的粮食作物之一，也是世界上一半人口的主粮。但是，各种病虫害的发生，严重制约了水稻的产量，其中，由稻瘟病菌引起的稻瘟病，是水稻最具威胁性的病害之一，而发掘和利用广谱持久的抗性基因，被认为是控制稻瘟病危害最有效、经济、环保的策略。在前期研究过程中，我们定位到一个稻瘟病主效基因Pi2-1, 为了精细定位Pi2-1基因，进一步将极端感病群体扩大至1019株。利用SRF52和AP4007在1019个极端感病单株中筛选重组单株，共鉴定到了109个重组子，其中，SRF52鉴定到75个重组子，AP4007鉴定到34个重组子。分别利用RM19795、RM19808、S29742、T6和AP5314等5对新的多态引物，对109个重组子进行基因型分析，最终将Pi2-1基因定位在S29742和T6之间，前者有1个重组子，后者有2个重组子，两个标记之间的遗传距离为0.2 cM。通过NCBI数据库和WhoGA数据库的在线注释分析，结果显示，N2、N3、N4最有可能是Pi2-1的候选基因。为了克隆Pi2-1基因，采用改良的PCR“富集”筛选法，从构建的TY基因组BAC文库中，筛选到包含Pi2-1基因的2个阳性单克隆，对阳性单克隆进行脉冲场凝胶电泳检测，单克隆片段大小分别约为87Kb和95 kb。利用Pi2-1区域16对特异性引物，对其进行PCR验证，该单克隆位于NPB基因组第6号染色体103580977～10438707 位置，基本覆盖了Pi2-1基因精细定位的区间。通过序列分析，设计引物利用TOYOBO高保真酶进行N4候选基因的PCR扩增，通过KpnI和SmaI双酶切，将N4候选基因的扩增片段连接到表达载体pCAMBIA1300上，目前，正在利用农杆菌介导法，进行遗传转化；而为了克隆N2、N3候选基因，我们与北京百迈客生物科技有限公司开展三代基因组测序合作，已完成2个阳性单克隆重叠群的测序工作，正在根据三代基因组测序的结果进行克隆工作。

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