凝血因子ⅧTrp1707Ser突变导致抑制物产生的细胞免疫机制研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
81170480
项目类别：
面上项目
资助金额：
50.0万
负责人：
王学锋
依托单位：
上海交通大学
学科分类：
H0805.出血、凝血、纤溶与血栓
结题年份：
2015
批准年份：
2011
项目状态：
已结题
起止时间：
2012-01-01 至2015-12-31

项目参与者：
陆晔玲；游国岭；姜林林；欧阳琦；周景艺；曹雅南；王鸿利；
关键词：
抑制物突变血友病A T细胞表位血管性血友病因子

项目摘要

血友病A(HA)替代治疗中30%-40%的患者产生凝血因子Ⅷ（FⅧ）抑制物，是HA治疗中亟待解决的问题。F8基因错义突变导致抑制物产生的细胞免疫机制研究可为以结构为基础的低免疫原性FⅧ制剂的研发提供理论依据。在本项目组发现的Trp1707Ser突变所致抑制物灭活FⅧ的分子机制研究基础上，本项目拟针对既与VWF结合相关又位于CD4+T细胞表位的Trp1707Ser突变特性，进一步探讨其抑制物产生的细胞免疫机制。制备突变及野生重组FⅧ（rFⅧ）及轻链（LC），合成T细胞表位短肽。表面等离子共振法测定各种rFⅧ及LC与VWF的结合。通过VWF结合及未结合各种rFⅧ、LC和短肽对携带该突变HA患者外周血和小鼠脾细胞免疫刺激、HA小鼠替代治疗，检测其抗体产生及免疫应答指标。探讨VWF降低FⅧ免疫原性的细胞免疫保护机制，阐明Trp1707Ser突变及突变所在的T细胞表位导致抑制物产生的细胞免疫机制。

结项摘要

在HA患者中发现的导致高滴度抑制物产生的突变Trp1707Ser，不仅位于与VWF结合相关的FⅧ 轻链位点上，又位于通用CD4+ T细胞抗原表位上，突变无论在位置还是结构上都可能与抑制物的产生有关。本项目研究首次将该突变两种特性结合起来，探讨其抑制物产生的细胞免疫机制。通过原核表达获得野生型和突变型的轻链后，检测其与VWF的结合情况；体外培养正常人的DC细胞，加入野生型或突变型轻链后，检测DC细胞的吞噬情况；用获得的野生型或突变型轻链刺激HA小鼠，检测小鼠体内抑制物产生情况以及免疫应答情况；将刺激后的小鼠脾脏中CD4+T细胞体外培养并再次刺激后，测定相关免疫细胞因子水平。结果显示，突变型轻链与VWF的结合无差异性，且DC细胞对野生型及突变型蛋白的吞噬情况无差异；HA小鼠经两种蛋白刺激后均未产生抑制物，且免疫应答情况均无异常，体外培养的CD4+T细胞分泌的细胞因子水平均正常。由于真核表达的不成功，我们建立了FVIII轻链体外原核表达并获得了相应的野生型和突变型蛋白用于后续实验，也因此导致实验结果与之前预期相差较大。然而，上述一系列结果的出现可能是由于原核表达的轻链无法代表完整FVIII蛋白所导致的抑制物产生，另外也可能说明1707位点并未参与FVIII与VWF结合，也不是T细胞识别位点。