基于单细胞分析探究肝癌克隆结构演变及其调控规律

The structures of clonal sub-populations that harbor different mutations are closely related to the initiation and progression of liver cancer, but population level analysis could not accurately determine either clonal structures or transcriptional regulations, necessitating single-cell level analysis. We recently employed single-cell RNA-Seq to delineate the gene expression heterogeneity in chemical carcinogen diethylnitrosamine (DEN) induced hepatocellular carcinoma (HCC) mouse model, and also revealed the frequently mutated genes by whole-exome sequencing. The way that mutations cause liver cancers via gene expression, as well as the regulatory control of clonal structure evolution, are still obscure. To address these questions, we plan to isolate cancer cells and stem/progenitor cells from different-staged DEN-induced liver tumors as well as human clinical samples via flow cytometry, and conduct single-cell gene expression analysis and single-cell targeted mutation analysis for the same cell population and even the same single cell. We expect to identify sub-populations in liver tumors based on single-cell gene expression profiles, and reveal the clonal structures of liver tumors and their dynamic evolutions based on single-cell mutational profiles. Combined analysis of single-cell level gene expression profiles and mutational profiles will bridge mutations and regulatory responses, and reveal the regulatory mechanisms of clonal evolution in liver tumors. This research will deepen our understanding of the genetic mechanism of hepatocellular carcinoma initiation and progression, and can also be used for liver cancer subtype classification and personalized precise medicines.

肿瘤包括肝癌的克隆结构与其发生发展密切相关，但群体水平分析无法精确揭示肿瘤克隆结构，也难以全面理解肿瘤表达调控机制，迫切需要进行单细胞水平的分析。申请人近期基于单细胞RNA测序初步揭示化学致癌物二乙基亚硝胺（DEN）诱导小鼠肝癌模型的基因表达异质性，并通过基因组分析揭示了该模型的高频突变基因，但突变如何通过基因表达引起肝癌以及克隆结构演变如何调控仍不清楚。本课题拟针对DEN诱导小鼠肝癌模型不同阶段样本以及人类肝癌临床样本，通过流式分选富集肿瘤细胞及干/祖细胞群体，对同一群细胞乃至同一个细胞同时开展单细胞表达谱及单细胞靶向遗传变异分析。基于单细胞表达谱揭示细胞亚群及表达调控，基于单细胞遗传变异揭示克隆结构及其演变，结合二者在单细胞水平探究遗传变异与表达调控的关系，阐明肝癌克隆结构及其演变的调控规律。本课题将加深对肝癌发生发展的遗传学机制认识，也为肝癌分型及个性化精准治疗等奠定基础。

肝癌克隆进化与其临床治疗、转移等密切相关，但传统的群体水平分析无法区分不同肿瘤亚克隆的突变共同发生情况，如何根据单一时间点样本重构其进化历史并揭示其调控规律是一大难题。本项目针对DEN诱导小鼠肝癌模型不同阶段样本以及人类肝癌临床样本，采用群体水平结合单细胞水平的表达谱及遗传变异分析来探究肝癌的克隆结构演化及其调控规律。本项目共产生~4000个高分辨率肝癌单细胞转录组，以及~500个单碱基分辨率肝癌单细胞突变图谱，除支持本项目各项发现外，也为未来肝癌异质性的深入研究提供了独具特色的数据资源。在DEN诱导小鼠肝癌方面，基于单细胞表达谱鉴定到不同细胞亚群并揭示其基因调控异质性，重现了化合物诱导肝癌进展过程。在遗传层面，DEN诱导肝癌早期肿瘤以单克隆结构为主，而晚期部分肿瘤出现了多克隆结构，结合同一肿瘤样本不同部位的分析重构了其克隆进化历史。在人类肝癌方面，本项目基于单细胞突变谱得以重构单一时间点肝癌样本的克隆进化历史，揭示肿瘤内存在进化阶段不同的克隆群体，而原发灶及门静脉癌栓（PVTT）的对比揭示二者共同起源但独立演变的单细胞谱系关系。在可靠的肿瘤克隆历史重构基础上，克隆群体特异突变的碱基改变规律提示早期肝癌进化过程可能与特定病因如马兜铃酸等有关。肝癌转录组及突变谱的整合分析，则进一步揭示肿瘤特异性突变通过改变其他基因而非其自身的表达水平引起表型异质性。针对肝癌的遗传异质性分析此前多停留在群体水平或单细胞拷贝数变化尺度，本课题首次实现了单细胞、单碱基水平的肝癌克隆进化分析，将加深对肝癌以至整个实体肿瘤克隆进化领域的认知。

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