致聋新基因MAP1B的鉴定及其致病机制研究

Deafness is a major global public health problem. There are more than 300 deafness associated loci on human chromosomes, but so far only about 100 deafness causative genes have been identified, it is anticipated that novel deafness causative genes could be found. In our previous work, by using Whole Exome Sequencing technology, we identified a novel deafness causative allele (c.4198 A>G, p.1400S>G) in gene MAP1B encoding Microtubule Associated Protein 1B. However, the pathogenesis of deafness caused by MAP1B mutation is less understood. The overall aims of this investigation are to further elucidate the pathophysiology of deafness caused by MAP1B mutation and to explore the strategy for the regeneration of auditory organ. The first aim is to explore the effect of MAP1B defect on the morphology change and dysfunction of nerve cells. The second aim is to evaluate if the MAP1B p.1400S>G mutation affects the induction of induced pluripotent stem cells (iPSCs) and iPSCs differentiating into spiral ganglion cells. Finally, we will test if a combination of iPSC technology with CRISPR/Cas9 technology can genetically correct the MAP1B mutation in the iPSCs carrying MAP1B p.1400S>G mutation and restore the morphology and function of the derived spiral ganglion cells. The implementation of this research, will contribute to a more comprehensive interpretation for deafness pathogenesis, and provide theory basis for deafness early intervention, diagnosis and treatment.

聋病是全球性重大公共卫生问题。预计在人类染色体上有300多个基因座与遗传性聋病的发生有关，但至今仅有近100个致聋基因被鉴定，新的致聋基因有待发现。前期的工作中，通过全外显子测序技术，我们在一个汉族显性遗传聋病家系中筛选到新的致聋基因MAP1B。本课题拟在此研究基础上，以神经母细胞瘤细胞及诱导多能干细胞（iPSCs）为模型进一步阐明MAP1B c.4198A>G突变的致聋机理：1）研究MAP1B缺陷对神经细胞形态和功能的影响；2）建立MAP1B c.4198A>G突变耳聋患者iPSCs及定向分化耳蜗螺旋神经节细胞（SGCs）体系，探索MAP1B c.4198A>G缺陷对SGCs的调控作用；3）利用CRISPR/Cas9技术对MAP1B c.4198A>G突变进行基因校正，探索SGCs功能重建策略。本研究的实施，将有助于更全面地诠释聋病的致病机制，为聋病的早期干预、诊断及治疗提供理论依据。

耳聋是一种复杂人类疾病。截至2018年，已经有113个与非综合征性耳聋相关的基因被发现，其中三分之一为常染色体显性基因。本研究中，我们发现了一个听力损伤的大家系，用外显子测序的方法找到了一个新的非综合征性耳聋致病位点MAP1B c.4198A>G（p.1400S>G）。.MAP1B（microtubule associated protein 1B，微管相关蛋白1B）属于微管相关蛋白家族，在神经系统的发育和功能中发挥重要作用。我们从家系入手，构建病人特异的诱导多能干细胞（iPSC）研究该MAP1B c.4198A>G突变在内耳听神经分化中的影响。实验结果表明，三种基因型的iPSCs都能分化为听神经前体细胞，且在标志基因的表达水平上没有明显差异，但进一步分化为成熟类听神经细胞时，我们发现MAP1B+/-细胞中MAP1B及神经标志蛋白TUJ1、BRN3A的表达量明显低于对照组；同时，听神经特异基因NEUROG1、NTRK2、NTRK3基因表达水平显著降低。WB、免疫荧光结果提示，突变细胞中稳定性微管蛋白表达量升高，微管处于过稳定状态，分化得到的类听神经细胞的轴突长度较正常对照细胞短30%。同时电生理结果显示，MAP1B突变的类听神经细胞表现出的神经成熟度较低，表现为外向钾电流电流密度小；诱发的动作电位幅值降低、波峰宽度增加、诱发阈值提高。基因校正可以修复突变组细胞所表现出来的异常表型，MAP1B+/c校正组细胞中标志蛋白和基因的表达水平均与正常对照组无明显差异。以上结果提示我们MAP1B c.4198A>G突变影响听神经细胞的延伸和成熟。.进一步，我们构建了Map1b基因敲除小鼠，发现MAP1B缺陷对小鼠内耳毛细胞没有明显影响，但对内耳螺旋神经节细胞的成熟和延伸有重要作用，MAP1B基因缺陷小鼠听性脑干反应（ABR）阈值升高、电生理反应成熟度降低。.综上所述，本研究利用病人特异的iPSC技术、CRISPR/Cas9基因校正技术和基因敲除小鼠模型发现了一个新的非综合征性听力损伤基因，为听力损伤的相关筛查提供了新的候选基因。

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