背根神经节中TLR8调节神经病理性疼痛的机制研究

Neuropathic pain is lacking of effective analgesics in clinic. The development of new and effective targets is urgently needed. Recent researches showed that immune molecular TLRs (Toll-like receptors) are expressed in peripheral sensory ganglion and regulate neuronal excitability and transmission of sensory information. By using Real-time PCR, we investigated the expression of all functional TLRs (TLR1-9, 11-13) in the dorsal root ganglion (DRG) in mice after L5 spinal nerve ligation (SNL). The results showed the TLR8 mRNA was the most increased TLR. However, the role of TLR8 in neuropathic pain is unknown. Using SNL-induced neuropathic pain model, combining, behavior test, morphological, molecular biological, pharmacological and electrophysiological methods, we will investigate: (1) The expression and cellular and organelle distribution of TLR8 in DRG after SNL; (2) The role of TLR8 in DRG in the development and maintenance of neuropathic pain; (3) The downstream signal pathway of TLR8 underlying neuropathic pain. This project will not only unveil the mechanism of TLR8 in mediating neuropathic pain, but also provide evidence for the development of the novel analgesics by targeting on TLR8.

神经病理性疼痛在临床上缺乏有效的镇痛药，因而有待发现新的有效的治疗靶点。最新研究显示，感觉神经节内免疫分子Toll样受体(TLRs)能调节神经元兴奋性和感觉信息传递。因此，我们用Real-time PCR检测了L5脊神经结扎(SNL)后10天，小鼠背根神经节(DRG)内所有功能性的TLRs(TLR1-9,11-13)基因表达，结果显示TLR8表达增加倍数最高。然而，TLR8在神经病理性疼痛中的作用和机制未见任何报道。为此，本项目将采用SNL诱导的神经病理性疼痛模型和行为学、形态学、分子生物学、药理学、电生理学等方法，研究(1)SNL后DRG中TLR8表达的时程、细胞定位和细胞器定位；(2)DRG中TLR8在神经病理性疼痛发生和维持中的作用；(3)TLR8参与疼痛调节的下游信号通路。本研究不但系统地阐明感觉神经节中TLR8调节神经病理性疼痛的机制，也为研发以TLR8为靶点的镇痛药物提供思路。

最新研究显示免疫分子Toll样受体（TLRs）在背根神经节（DRG）和脊髓中参与了痒和疼痛的病理进程。但TLR8（与TLR7是一家族）是否参与神经病理性疼痛调节还不清楚。我们构建TLR8-/-小鼠，检测其在疼痛和痒中的作用。结果显示：TLR8-/-小鼠免疫系统和TLR7表达正常，痒觉和基础痛阈也正常，但神经病理性疼痛行为减轻（SNL，脊神经结扎模型）。SNL后脊髓TLR8表达增加，源自DRG。DRG中TLR8主要位于中小型神经元，人类也类似。干扰DRG中TLR8表达使SNL3d后神经病理性疼痛减轻，说明TLR8在神经病理性疼痛维持阶段发挥作用。TLR8激动剂VTX在TLR8-/-小鼠中不能诱发自发痛，但在TLR7-/-中仍能诱发自发痛，说明VTX的作用依赖于TLR8。SNL后TLR8-/-小鼠脊髓中星胶和小胶反应也减轻。TLR8表达于DRG神经元的内涵体、溶酶体和内质网中。经典的TLRs下游是通过MyD88介导NFκB激活及随后的炎症因子表达。而我们实验发现TLR8激动剂不能激活DRG中NFκB、p38、JNK，但能激活ERK通路，荧光素酶实验也证实此结果。鞘内注射VTX能剂量依赖性诱导野生型和MyD88-/-小鼠产生机械性触诱发痛，说明VTX诱导的机械性触诱发痛和ERK激活非依赖于DRG中的MyD88。虽然DRG中TLR8和人单核巨噬细胞TLR8存在位置相似，但上述结果提示DRG神经元TLR8下游信号异于免疫细胞。SNL后miR21增加远高于miR29。在损伤的DRG，miR21依赖TLR8激活ERK和炎症介质产生。miR21可以表达在DRG所有神经元内，因此它可以从其他神经元释放至TLR8阳性神经元。为此本项目阐明了TLR8和内源性配体miR-21在神经病理性疼痛维持中发挥了重要作用。机制上，TLR8经非经典通路激活ERK和炎症介质产生、增加神经元兴奋性，发挥神经病理性疼痛维持作用。部分结扎眶下神经（pIONL）诱导的三叉神经痛模型中TLR8也在三叉神经（TG）神经元中持续增加，敲除或敲减TG中TLR8能减轻pIONL诱导的机械性触诱发痛、TG中ERK和p38激活、及促炎症因子表达。TG内注射VTX诱导面部痛觉过敏、增加TG神经元钙信号、ERK和p38激活、以及促炎症因子表达。因而TLR8和miR21在神经病理性疼痛维持阶段发挥作用可能成为治疗此疾病的新的靶点。

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