氟喹诺酮类药物达氟沙星致猪肾小管上皮细胞损伤的分子机制研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31101859
项目类别：
青年科学基金项目
资助金额：
24.0万
负责人：
刘兆颖
依托单位：
湖南农业大学
学科分类：
C1808.兽医药物学与毒理学
结题年份：
2014
批准年份：
2011
项目状态：
已结题
起止时间：
2012-01-01 至2014-12-31

项目参与者：
王慧；张大生；俞春红；
关键词：
Caspase信号通路氧化应激 LLC-PK1细胞氟喹诺酮类药物细胞凋亡

项目摘要

氟喹诺酮类药物出现的不良反应及其分子机制已引起人们的高度关注。目前，国内外主要研究了氟喹诺酮类药物致中枢神经不良反应和软骨毒性的分子机制，并证明这些毒性都与氧化应激有密切的关系，而对该类药物的肾毒性机制至今未见阐述。本项目选择氟喹诺酮类动物专用药物达氟沙星为研究对象，以猪肾小管LLC-PK1细胞为试验模型，以本类药物能产生氧自由基为切入点。研究达氟沙星诱导LLC-PK1细胞氧自由基生成和脂质过氧化、细胞调亡与线粒体功能障碍，以及在氧化应激作用下，LLC-PK1细胞中氧化还原系统与抗氧化酶活性的变化；再应用RT-PCR、Western-blot等常规分子生物学方法，研究LLC-PK1细胞ASK1/JNK和Caspase信号通路中重要基因及蛋白表达的变化，从而阐明达氟沙星致猪肾上皮细胞损伤的分子机制，为指导兽医临床合理用药和防治其毒性提供重要的科学依据，也为食品安全性评价提供重要的理论参考。

结项摘要

研究组圆满完成了项目的所有研究内容。以FQs药物能产生氧自由基为切入点，研究了达氟沙星诱导LLC-PK1细胞氧自由基生成和脂质过氧化、抗氧化酶活性的变化、细胞调亡与周期、线粒体功能障碍，以及在氧化应激作用下，细胞周期中重要基因及蛋白表达的变化。其主要成果如下：.达氟沙星呈时间和剂量依赖性抑制体外培养的LLC-PK1细胞增值。在不诱导细胞毒性的浓度范围内，达氟沙星能浓度依赖性诱导细胞内ROS，O2-和H2O2的含量升高，细胞内MDA的含量增加4.1倍。 100、200、400 μM达氟沙星孵育24h后，细胞内的抗氧化酶SOD和CAT的酶活性显著增高，而GSH-PX酶活性呈浓度依赖性降低。GSH和NAC具有拮抗达氟沙星诱导LLC-PK1细胞氧化损伤的保护作用。流式细胞仪检测不同浓度的达氟沙星处理LLC-PK1细胞后的凋亡情况，只有400μM孵育48h才对细胞产生较大程度的凋亡，凋亡率为22.7%。无细胞凋亡时，细胞的线粒体膜电位也无变化。但达氟沙星浓度为100μM时，G2期细胞比例显著升高了10%，细胞发生G2期阻滞；而浓度达到400μM时，细胞发生G1期阻滞。达氟沙星浓度为400μM时，能引起细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂p21、p53、p27的mRNA表达量显著升高，细胞周期素cyclinA、cyclinE1、cyclinD3升高，但显著降低cdc25c磷酸酶、cdk1、E2F1的mRNA表达量。蛋白印迹分析显示其对cdk1、cdk2，cyclinA、cyclin E1蛋白表达无影响。部分研究结果发表在Basic Clin Pharmacol Toxicol。.研究表明：达氟沙星诱导LLC-PK1细胞毒性是由于生成了过量的H2O2所导致，药物产生的氧自由基被激活的SOD和CAT所清除，GSH和NAC具有拮抗达氟沙星诱导LLC-PK1细胞氧化损伤的保护作用。达氟沙星诱导细胞内H2O2升高时，细胞仅发生G1与G2期细胞周期阻滞，不诱导细胞凋亡，说明细胞处于一种可修复状态。从而首次揭示了达氟沙星的肾毒性由氧化应激介导，且与长期用药有密切关系，阐明了其致LLC-PK1细胞周期阻滞的分子调控机制。从而为指导兽医临床合理用药和防治其毒性提供了很大的实际指导意义，也为食品安全性评价提供重要的理论参考。