基于基因搜索和转座子组学的生物被膜新基因克隆及其生防功能分析

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31201574
项目类别：
青年科学基金项目
资助金额：
23.0万
负责人：
黄天培
依托单位：
福建农林大学
学科分类：
C1406.生物防治
结题年份：
2015
批准年份：
2012
项目状态：
已结题
起止时间：
2013-01-01 至2015-12-31

项目参与者：
郑伟文；潘洁茹；苏新华；潘晓鸿；张君；张巧铃；
关键词：
基因搜索生物被膜转座子组学功能

项目摘要

Due to negative influence of ultraviolet (UV), the living periods of Bacillus thuringiensis (Bt) are not long enough to maintain a sustainable insect pest control. Biofilm can regulate the toxicities and anti-UV abilities, but few data are available for the anti-UV abilities of strains with biocontrol abilities. This project will choose a Bt strain, showing good biofilm formation, high toxicity and anti-UV ability, for next generation sequencing (NGS). The change of the biofilm related genes might result in higher toxicities and better anti-UV abilities. In this case, the strain, containing the genes, were analyzed for its insecticidal crystal proteins (ICPs), growth curve, motility, spore rate and the inducement of the genes by insect alkaline conditions. The expression profile of key genes (recA and umu) for UV resistance were also investigated. These should elucidate the mechanisms how biofilm related genes regulate the anti-UV, and provide data for produce new Bt based pesticides with longer living periods in the field.

苏云金芽胞杆菌（Bt）因受紫外线等不利影响，导致田间应用持效期较短，严重影响了其对害虫的控制效果。生物被膜（biofilm）能调控肠道病原菌等细菌的毒力和抗紫外线能力，但其对生防细菌Bt抗紫外线等生防活性的影响知之甚少。本项目拟针对1株生物被膜形成能力强、杀虫/抗紫外线效果好的Bt菌株进行全基因组测序和分析，利用转座子随机插入突变，获得影响杀虫/抗紫外线能力的Bt生物被膜相关基因，进一步根据杀虫晶体蛋白含量、生长曲线、群游试验、芽孢形成、生物被膜相关基因受昆虫中肠碱性条件诱导的活性、紫外线抗性关键基因recA和umu操纵子基因表达等数据，解析生物被膜相关基因调控Bt抗紫外线等生防活性的作用机制这一关键科学问题，为研制基于生物被膜的田间期效期更长的Bt新型制剂提供依据。

结项摘要

微生物杀虫剂苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）由于田间应用持效期较短，进一步发展受到限制。其主要原因之一是Bt易受外界环境因素（如紫外、高温、干旱等）和自身因素（如定殖、毒力等）的影响。生物被膜是细菌适应环境的一种特殊的生长状态，能调控细菌对环境胁迫的适应能力，与细菌的定殖、侵染、毒力等多种特性密切相关。本研究筛选并鉴定产生物被膜Bt菌株，并探索了生物被膜对Bt生物防治效果的影响。.本研究首先开展了对部分Bt菌株的特性鉴定，并对88株Bt菌株进行生物被膜产生菌的筛选，获得了一株高效形成生物被膜的Bt菌株XL6，其分离自内蒙古自治区。Bt XL6菌株释放的伴胞晶体为菱形，存在晶胞粘连现象，只有1条23 kb的质粒。Bt XL6菌株可以表达130 kDa的原毒素，并且可被胰蛋白酶进一步消化形成60 kDa的活性毒素。Bt XL6菌株中含有生物被膜相关基因约74种。Bt XL6菌株在LBP、LB培养基气-液界面能形成清晰的膜状结构。已完成了该菌株的全基因组测序，发现基因组全长5,308,217 bp，含有5875个开放阅读框，5534个基因，171个假基因，1740个可能蛋白，63个tRNA，17个rRNA，1个质粒。.基于pIC333和Bt 407构建了Bt转座子组学研究技术平台，进一步构建了Bt XL6菌株随机插入突变体库，筛选到2株生物被膜形成能力显著降低的突变株，找到其插入位点均位于ggedf基因上游。GGDEF结构域包含5个保守氨基酸，分别为甘氨酸2个、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸。与野生菌株Bt XL6相比，突变株的群游能力、生长速度下降。此外，通过同源重组验证了ggdef基因调控Bt生物被膜的形成。利用比较基因组学初步分析了Bt生物被膜形成相关基因受昆虫中肠碱性和生长条件等环境条件的影响，并探讨了recA、umu和LexA对Bt XL6和Bt HD73生物被膜形成的调控。.为了研究生物被膜的定殖，携带gfp基因的pSTK质粒电转化至Bt XL6菌株中。对数期的细胞能够在接触表面，甚至在根表面迅速形成生物被膜。.本研究结果这些将为基于生物被膜的高效持久的Bt杀虫剂的研制提供研究思路。