p18及Cdc42/PKCα介导VE-cadherin再循环调控内皮屏障功能的作用及机制研究

The mortality rate of sepsis induced acute lung injury is still high, while the major cause of mortality is the acute pulmonary edema characteristic by the increase in pulmonary vascular endothelial permeability. Traditional studies mainly focus on the vascular endothelial cell junction proteins and their post-translational modifications, however, the clinical application is ineffective. Our recent study revealed that Rab11a mediated VE-cadherin recycling is essential to maintain the endothelial barrier function in sepsis induced acute lung injury. Meanwhile, our preliminary data showed that p18 directly bind with cytoplasmic tail of VE-cadherin, and inflammatory mediators activated Cdc42/PKCα protein may act through Rab11a endosome to participate in the protein recycling. Based on our previous studies and literatures review, we propose that p18 directly bind with VE-cadherin and successively increase the VE-cadherin in the recycling endosome; Meanwhile, activated Cdc42/PKCα acts through Rab11a and modulates the recycling of VE-cadherin. Using the combination of molecular, cellular and whole animal approaches, the present proposal will further elucidate the molecular mechanisms of p18, Cdc42/PKCα in the modulation of Rab11a/recycling endosomes participating in the VE-cadherin recycling and endothelial permeability. Thereby providing new directions for designing therapeutic strategies and drug development for acute lung injury.

脓毒症导致的急性肺损伤死亡率居高不下，肺血管内皮通透性增加引起的急性肺水肿是主要死因。传统针对血管内皮细胞连接蛋白及其翻译后修饰的研究，临床应用效果欠佳。最近我们发现，Rab11a介导的VE-Cad再循环在内皮细胞屏障功能修复中至关重要。预实验结果及前期研究显示：p18与VE-Cad胞内序列结合，炎症介质可激活Cdc42/PKCα及Rab11a并参与蛋白再循环。因此，我们推测，p18与VE-Cad直接结合而参与VE-Cad自初级内体至再循环内体过程；激活的Cdc42/PKCα通过Rab11a介导VE-Cad再循环。本课题将从离体细胞培养及整体动物实验水平，采用分子生物学等方法，进一步探讨p18、Cdc42/PKCα在Rab11a/再循环内体中调控VE-Cad再循环中的作用机制及对内皮屏障功能的影响，以此为急性肺损伤提供新的治疗策略和为药物研发提供新的靶点。

前期研究证实，内吞的VE-Cad再循环到细胞膜表面对维持膜表面VE-Cad的稳定性表达起重要作用， Rab11a在VE-Cad转运及再循环利用中起重要作用，但VE-Cad内吞后如何分选进入再循环内体，再循环内体接受VE-Cad转入后如何启动/活化Rab11a信号通路并参与VE-Cad再循环均尚无报道。本课题从离体细胞培养及整体动物实验水平，采用分子生物学等方法，探讨p18、Cdc42/PKCα在Rab11a再循环内体中调控VE-Cad再循环中的作用机制及对内皮屏障功能的影响。. 第一部分，我们首先通过基因转染、钙离子转换实验、免疫荧光共聚焦显微镜等方法探索了p18对人肺血管内皮细胞膜表面VE-Cad表达及内吞后转运的影响，发现p18基因下调后细胞膜表面VE-Cad表达及内吞后再循环减少，过表达p18可明显增加VE-Cad在细胞膜表面表达及再循环。在TER实验及FITC细胞通透性实验中，我们证实下调p18基因，可以造成人肺血管内皮细胞的通透性增加，且凝血酶刺激后其通透性难以恢复。凝血酶刺激的内皮细胞，p18及Rab11a与VE-Cad结合呈时间依赖性，且p18的结合早于Rab11a，若p18基因下调则造成Rab11活化减少、Rab11a与VE-Cad结合受影响。通过GST-pull down实验我们发现p18（1-39aa）序列与VE-Cad CT直接结合。最后通过小鼠体内实验，证实p18蛋白对于动物肺脏微血管通透性及屏障功能维持具有重要意义。. 第二及第三部分，我们分别探讨Cdc42及PKC在Rab11a介导的VE-Cad蛋白内吞后再循环的影响，通过实验发现Cdc42基因下调后造成VE-Cad蛋白在细胞膜表面表达减少及内吞后再循环的受阻，且Cdc42与Rab11a在人肺微血管内皮细胞中共定位；另外，前期研究证实凝血酶可以促进PKC活化，而Rab11是PKC的底物，免疫印迹方法证实，凝血酶刺激的Rab11a发生色氨酸位点磷酸化，提示Cdc42/PKC均可通过Rab11a介导VE-Cad内吞后再循环。. 本课题完善VE-Cad再循环分子机制研究，对新药的开发和急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的治疗提供重要理论依据。

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