P-body在PRRSV复制和持续感染过程中的作用机制研究

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS), caused by Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV), a RNA virus, is characterized by immunosuppression and persistent infection. PRRS brings about significant economic losses in the pig industry, yet effective therapeutic methods have not been elucidated. P-body is an important site for the degradation and storage of intracellular mRNA. In our previous studies, we expressed LSm14A (RAP55/SCD6), an important component of P-body in vitro, and found that expression of LSm14A was compromised during PRRSV infection. Both virion and non-structural protein 2 (NSP2) of PRRSV showed antagonistic effect on LSm14A mediated innate immune activity. However, the roles of the P-body components (e.g. LSm14A) in PRRSV persistent infection and their interactions to PRRSV structural or nonstructural proteins, remain unclear. Therefore, the PRRSV replication and persist infection mechanisms regulated by P-body components will be explored by confocal laser imaging scanning, co-immunoprecipitation, immunoblotting and mass spectrometry approaches. The colocalization of LSm14A and viral proteins will be characterized in PRRSV infected T cells to reveal mRNA diminish and accumulation kinetics. Then, the localization pattern of P-body components will be investigated on the viral replication sites. This will provide reliable information to clarity potential role of RNA processing machinery in PRRSV infectious pathogenesis for virus replication, disease prevention and control.??

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）可引起宿主免疫抑制和持续性感染，至今仍缺乏有效的防治措施。P-body是细胞内降解、储存mRNA的重要场所,我们在前期的研究中发现P-body重要组件LSm14A在PRRSV感染过程中mRNA和蛋白水平均发生了变化。PRRSV全病毒与病毒的非结构蛋白2（NSP2）均表现出对LSm14A天然免疫活性的拮抗作用。但是，LSm14A等P-body组分是否在PRRSV持续感染中的作用以及与PRRSV的相互作用机理尚不清楚。本项目拟在此基础上从病毒与宿主相互作用入手，通过激光共聚焦定位、质谱分析等方法，明确影响PRRSV复制的P-body组件，研究LSm14A及其它P-body组件蛋白在PRRSV感染与复制过程中的作用机制，最终为PRSSV防控提供新的策略。

猪繁殖与呼吸综合征病毒可引起宿主免疫抑制，P-body是细胞内降解、储存mRNA的重要场所，为研究P-body组件蛋白在PRRSV感染与复制过程中的作用机制。本项目首先构建了携带PRRSV 病毒蛋白、P-body 主要组件分子的原核与真核表达载体，制备了相应的抗体。其次分离鉴定了5株PRRSV地方毒株，对GZZJ201711和GZBJ201712毒株进行全基因测序列与分析发现：两株毒株基因全长分别为14962bp、15322bp，GZZJ201711毒株NSP2区域为30aa缺失，GZBJ201712 NSP2区域为30+120aa的缺失类型。间接免疫荧光试验结果发现感染PRRSV 24、48h后Marc145 细胞内RAP55指示的颗粒状P-body 分子逐渐增多；P-body 组件蛋分子定位于细胞浆，可以改变其组装状态，在细胞浆存在弥散分布与颗粒状态两种形式。荧光定量PCR试验分析了PRRSV 感染后Marc145细胞内58个P-body 组件分子转录水平的变化，其中PUM1、APOBEC3F、DCP1a，等40个基因mRNA转录水平下调；ILF3、UPF1、LSM4、PUM4、LSM5、DDX50、DHX16、DHX34、DDX41、DDX39A，10个基因mRNA转录水平上调；而UPF2、TNRC6B、SMG、TNRC6C、SMG1、RO52，6个基因mRNA转录水平没有任何变化；PRRSV感染后Marc145细胞中LSm1转录水平各个时段明显增加；DCP2转录水平在8-48 h时期明显升高；感染PRRSV 6 h Marc145细胞中EDC3的mRNA转录水平显著升高，感染PRRSV 24 h、36 h EDC3的mRNA转录水平显著下调，说明PRRSV复制过程对Lsm1、DCP2、EDC3等分子转录水平有一定程度的影响。感染PRRSV不同时间点Marc145细胞中的RAP55分子蛋白水平表现出上调。EDC3、SETD2对PRRSV的复制有一定的抑制作用，而且EDC3与干扰素α具有协同抑制PRRSV作用。 综上结果为研究PRRSV感染与复制过程中的作用机制奠定基础，最终为PRSSV防控提供新的策略。项目资助发表论文12篇（见刊），收录3篇。培养硕士生9名，其中5名已经取得硕士学位，4名在读。项目各项支出基本与预算相符，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。

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