电压控制Click化学法构筑多通道DNA和核酸适配体电化学传感器

Electrochemical DNA and aptamer biosensor is versatile, specific and high affinity, observations that have motivated decades of research aimed at adapting biomolecules into a general platform for molecular sensing. Interest in the development of versatile, sensitive, selective, rapid, and cost-effective DNA and aptamer-based electrochemical biosensors for biomedical analysis, environmental monitoring, and the detection of bioterrorism agents is rapidly increasing. Multiplexed detection of biomarkers such as DNA and proteins is of utility for laboratory assays as well as clinical and point-of-care disease diagnostics. A classic biosensor directly transduces ligand-target binding events into a measurable physical readout. "Click" chemistry, addition reaction of alkyne biomolecules to azide derivatives, however, has rarely been employed in the fabrication of biosensors to date. Of note, since the generation of Cu(I) is potential-dependent, potential-assisted ''click'' chemistry can be utilized in the fabrication of a multi-pixel sensor array by varying the potential applied to each pixel. Thus, surface confined molecules can be activated from the chemically inert "OFF" state to its "ON" state by applying an external voltage to each device electrodes in multiplexed electrode. These approaches can potentially be implemented in the fabrication of multiplexed biosensor arrays for simultaneous detection of multiple clinically-relevant targets for point-of-care diagnosis.

近年来，DNA及核酸适配体电化学生物传感器由于其灵敏度高、选择性好、成本低廉，在生物医学分析、环境监测等领域引起了人们广泛的关注。随着电极阵列与微流控系统等技术的发展，多功能化和智能化将是未来生物传感器发展的必然趋势。因此，不同生物识别元件在电极表面的固定，选择性地对不同电极阵列单元进行生物分子功能化，对复杂生物样品的多通道检测，是未来生物传感器发展亟待解决的问题。本项目旨在利用Click化学法，巧妙利用控制电压方法，对不同电极阵列单元进行选择性地电极活化、控制电极开关(on 或off)，从而对不同的电极阵列单元选择性地进行生物分子的表面功能化，进而构筑多通道的DNA或核酸适配体电化学生物传感器，用于多种不同DNA和蛋白质等目标分子同时的检测，为生物医学早期诊断提供理论依据和技术指导。

基于电压控制点击化学的方法以平版印刷电极为基底制备了p53序列传感器，并对传感器的性能进行的研究。讨论了金沉积到平板印刷工作电极上的最佳时间，为后续的自组装提供较为平滑的基底。研究了自组装单层膜构建方式对于传感器性能的影响，使用分步组装C11-N3和C11-OH的方法制备的传感器性能更加稳定。分步组装法制备传感器的信号抑制百分比高于同步组装法，由此判断电压控制点击反应过程应使用分步组装的方法。优化了TBTA与铜离子提前鳌合时间以及铜离子的浓度，在其他相同的实验条件下，得到TBTA与铜离子预先鳌合5min有利于成环反应，平衡电流ACV可提高2.3倍。由于Cu2+对DNA序列有一定的降解作用，最优的铜离子浓度对检测结果影响也很大，经过对比四个不同浓度铜离子平衡电流ACV，得到最佳铜离子浓度为200 μM。在已知理论的基础之上研究了施加工作电压对于点击反应效率以及传感器性能的影响，得到了最佳工作电压为-0.37V。在最佳条件下，探讨了新方法制备的传感器的电化学性能，结果表明：制备的传感器具有优良的电化学性能，不仅能特异性的识别p53基因，而且还能够重复利用，电化学性能几乎不发生变化。进一步探讨了新传感器的稳定性能和使用寿命，都得到了理想结果。.电压控制点击化学的方法在制备p53序列传感器上的成功应用实现了对于反应位点的精确控制，可将其拓展应用与多通道微阵列传感器的制备，通过控制不同通道和阵列位点的电压开关以及反应时间实现多种探针分子的可控连接，进而高通量的对DNA序列进行检测。.有了以上的基础，未来将充分利用“电压控制点击化学”的方法用于制备多通道的DNA阵列，通过控制各阵列点电压的“开”或“关”将不同的基因探针固定到相对应的阵列位点上，从而实现对于多个目标分子的同时测定。

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