lncRNA MEG3／miR-188-3p／MLH1- ATG7网络调控非梗阻性无精症精子发生的机制研究

Non-obstructive azoospermia (NOA) is one of the most difficult male infertility, and its molecular mechanism remains unclear. We through bioinformatics prediction, the applicant found the binding site of LncRNA MEG3 and miR-188-3p, and the ATG7 was the target gene of miR-188-3p. Our previous study showed that the down regulation of miR-188-3p promoted apoptosis of spermatogenic cells by up-regulating MLH1. It is suggested that MEG3 may participate in NOA as the expression of ceRNA regulating MLH1 and ATG7. In autophagy and apoptosis network ATG7, P53 protein molecules play an important role in the node, such as the early found MEG3 downstream of P53 in NOA testicular tissue increased, prompt MEG3 / miRNA-188-3p may autophagy and apoptosis through the network to participate in the occurrence of NOA. This project integrates multiple disciplines (high-throughput sequencing, proteome and genome) and other interdisciplinary technologies, Analysis of the role and molecular mechanism of MEG3 in NOA; To clarify the molecular mechanism of MEG3 in regulating autophagy - apoptosis network; To reveal the association between MEG3/ miR-188-3p and anspermia. To provide new targets and theoretical basis for diagnosis and treatment of male infertility.

非梗阻性无精症(NOA)是最难治愈的男性不育症之一，发病机制尚不明确。申请人通过生物信息学预测发现LncRNAMEG3与miR-188-3p存在结合位点，ATG7是miR-188-3p的靶基因。结合前期研究发现MLH1也是miR-188-3p的靶基因，导致生精细胞凋亡，提示MEG3可能作为ceRNA调控MLH1及ATG7的表达参与NOA的发生。在自噬-凋亡网络中ATG7，P53等蛋白分子发挥着重要的节点作用，申请人前期发现MEG3下游的P53在NOA睾丸组织中高表达，提示MEG3/miR-188-3p可能通过自噬-凋亡网络参与NOA的发生。本项目整合多组学(高通量测序及基因组)等交叉学科技术，解析MEG3在NOA发生中的作用和分子机制；阐明MEG3参与调控自噬-凋亡网络的分子机制；揭示MEG3/miR-188-3p与无精症的关联。为诊断和治疗男性不育提供新的靶点和理论依据。

近年来研究发现非编码RNAs，包括LncRNAs、miRNAs等在精子发生过程中发挥着重要调控作用。LncRNAs与miRNAs可以通过相互作用进而调控下游信号通路，从而参与精子发生过程。本项目在前期工作中通过生物信息学预测发现LncRNAMEG3与miR-188-3p存在结合位点，ATG7是miR-188-3p的靶基因，提示LncRNAMEG3可能作为ceRNA调控ATG7的表达参与NOA的发生。在凋亡-自噬网络中ATG7，p53等分子发挥着重要的节点作用，前期我们发现LncRNAMEG3下游的p53在NOA睾丸组织中高表达，提示LncRNAMEG3/miR-188-3p可能通过凋亡-自噬网络参与NOA的发生。为了验证以上假说，我们首先，通过RT-qPCR、原位杂交及免疫组化检测提示LncRNAMEG3、ATG7及自噬与凋亡相关蛋白等在NOA患者睾丸组织中存在差异性表达，并在人NTERA-2细胞系中进行验证，提示其可能与NOA患者精子发生相关。进一步通过体内实验，采用小鼠曲细精管显微注射技术成功构建睾丸组织LncRNAMEG3过表达小鼠模型，模拟NOA患者睾丸组织内LncRNAMEG3高表达环境，发现LncRNAMEG3可能通过下调PCNA蛋白的表达水平，抑制生精细胞增殖；通过激活caspase信号通路，促进生精细胞凋亡；LncRNAMEG3与miR-188-3p之间存在负向调控关系。随后，在体外实验中，通过双荧光素酶报告基因等方法在人NTERA-2细胞中证实LncRNAMEG3/miR-188-3p、miR-188-3p/ATG7存在靶向结合关系；又分别过表达与抑制miR-188-3p、LncRNAMEG3后检测细胞凋亡与自噬水平，验证了LncRNAMEG3-miR-188-3p调控网络对细胞凋亡与自噬的影响。最后，构建过表达LncRNAMEG3同时抑制自噬关键基因ATG7的细胞系模型，发现抑制自噬相关蛋白表达后凋亡相关蛋白表达也随之降低，提示LncRNAMEG3可能通过介导凋亡与自噬的交互作用参与NOA精子发生过程。本研究系统阐明了LncRNAMEG3/miR-188-3p/ATG7非编码RNA网络调控体系参与NOA患者精子发生的分子机制，为诊断和治疗NOA提供了新的靶点和理论依据。

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