烟雾病RNF213 R4810K突变对血管平滑肌细胞增殖迁移的作用及相关机制研究

Moyamoya disease (MMD) is a rare cerebral vascular disease characterized by frequent relapse, high mortality and morbidity, and lack effective treatment. It is extremely urgent to uncover its pathogenesis. The p.R4810K mutation of RNF213 gene is the most common mutation in East Asians with MMD, while the excessive proliferation and migration of vascular smooth muscle cells is the main.pathological processes in MMD. Previous studies have found RNF213 R4810K mutation may cause vascular endothelial cells dysfunction, but whether it could cause proliferation and migration of vascular smooth muscle cells in MMD remained largely unknown. In the study, we intend to extract fibroblasts of familial Moyamoya disease (fMMD) patients who carry RNF213 R4810K mutation, then reprogram the fibroblasts to induced pluripotent stem cells (iPSC), which are used to differentiate into vascular smooth muscle cells and endothelial cells in order to model moyamoya disease in vitro. At the same time, transgenic mice expressing the mutant RNF213 R4810K are used for further in vivo study. We hope to reveal the probable relationship between this frequent mutation and pathological changes of vascular smooth muscle cells by using multi-methods. Aiming at elucidating the pathogenesis of MMD from genetic, molecular, cellular and animal level, then providing new ideas and targets for prevention, treatments and drug screening for MMD.

烟雾病是一种罕见的脑血管病，其反复发作、死亡率及致残率高，缺乏有效的治疗方法，急需对其发病机制进行深入研究。RNF213基因的p.R4810K变异是东亚地区烟雾病最常见的突变，而血管平滑肌细胞过度增殖迁移是烟雾病最重要的病理过程。既往研究发现RNF213 R4810K突变可导致血管内皮细胞功能异常，但它是否与烟雾病的血管平滑肌细胞过度增殖迁移有关尚无研究。本项目提取携带RNF213 R4810K突变的家族性烟雾病患者的成纤维细胞，通过iPSC技术分化为血管平滑肌细胞和内皮细胞，构建烟雾病的细胞模型，并利用CRISPR Cas9技术修正突变基因作为对照，同时采用RNF213 R4810K突变的转基因小鼠模型进行在体实验，通过多平台深入研究烟雾病RNF213突变对血管平滑肌细胞增殖迁移的作用机制，从基因、分子、细胞、动物水平全面阐明烟雾病的致病机理，为烟雾病的防治及药物筛提供新的思路和靶点。

烟雾病是一种罕见的脑血管病，其反复发作、死亡率及致残率高，缺乏有效的治疗方法，给患者和国家带来了沉重的社会负担和经济负担。然而由于缺乏合适的疾病模型，难以准确模拟烟雾病的发生发展过程，使得对烟雾病的研究受限。RNF213基因的p.R4810K变异是东亚地区烟雾病最常见的突变，而血管平滑肌细胞过度增殖迁移是烟雾病最重要的病理过程。.本课题收集了神经内科、神经外科门诊及住院的烟雾病患者的临床资料及血标本，对280余名患者进行了R4810K基因突变筛查，发现共有25例患者及5名患者直系亲属检测出R4810K。我们提取了25例R4810K突变患者的外周血单个核细胞（PBMC）并将其冻存处理，将3例R4810K突变患者的PBMC利用IL-2和CD3选择性激活和扩增T细胞，先获得高纯度T细胞，然后用携带重编程因子OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC的仙台病毒转染T细胞，将其重编程为人诱导多潜能干细胞（iPSC）。利用CHIR99021，BMP4，N2B27 medium，PDGF-BB，ActinA等将患者来源的iPSC定向分化为平滑肌细胞，并进行鉴定；利用VEGF StemPro-34 SFM，FACS Aria II分选型流式细胞仪将患者来源的iPSC定向分化为内皮细胞，并进行鉴定，与健康对照者iPSC分化来的内皮细胞进行对比，发现烟雾病组IPSC分化的内皮细胞细胞增殖缓慢，细胞更大，UEA-1 核内结合荧光更强，VE-cadherin 膜上表达不完整，膜结构不清晰。还使用电转的方法获得了无饲养层，无外源基因，无病原学的含R4810K突变的烟雾病患者的临床前级别iPSC，并在网站（https://hpscreg.eu/cell-line/HUSTTJi001-A）注册，为研究含R4810K突变的烟雾病提供良好的细胞模型，也为研究烟雾病的发病机制提供良好的工具，为下一步寻找烟雾病新的干预靶点及药物筛选提供依据。

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