苏云金芽胞杆菌cry8E操纵子中辅助蛋白基因orf1的功能分析

Accessory proteins which are widely spread in many cry gene operon of Bacillus thuringiensis is involved in much accumulation and crystallization of Cry protein. We previously reported that B. thuringiensis cry8E and an upstream gene (orf1) were co-transcribed, and transcription of the cry8E gene started from two promoters: Porf1, which is located upstream of the orf1 gene and Pcry8E, located in the intergenic region mapping between orf1 and cry8E. Of the known, similar orf1-cry operons, this is the first report of the existence of a promoter between the intergenic region between orf1 and cry genes. Porf1 is controlled by the σE factor and Pcry8E by the σH factor. Based on previous study, this project plan to carry on the effect of accessory protein gene orf1 to expression of B. thuringiensis cry8E and biochemical characters of Cry8E protein, and explore molecular mechanism of accessory protein ORF1 to expression regulation of B. thuringiensis Cry8E and its roles in the crystallization of Bt Cry protein, to illustrate the biological function of accessory protein ORF1 in the novel type of cry gene promoter. The achievement of this project will provide a theoretical basis for developing to use accessory protein gene to promote production and stabilization of B. thuringiensis Cry protein.

辅助蛋白（Accessory protein）在苏云金芽胞杆菌中广泛存在，并与杀虫晶体蛋白的高效表达和晶体形成密切相关。申请人在前期的研究中发现cry8E基因表达是由两个启动子控制的，分别位于orf1基因上游和orf1基因与cry8E基因之间，并分别受SigE和SigH因子调控；在orf1和cry8E基因间隔区存在启动子活性，这在cry基因启动子中尚属首次报道，说明cry8E基因的启动子是一种新的启动子类型。在这些研究基础之上本研究拟开展辅助蛋白基因orf1对cry8E基因表达、Cry8E蛋白生化特性和杀虫活性的影响，明确辅助蛋白ORF1在苏云金芽胞杆菌细胞中的分布并探索其在Cry蛋白晶体形成中的作用，为今后开展利用辅助蛋白基因提高苏云金芽胞杆菌发酵生产过程中Cry蛋白的产量和稳定性提供理论基础。

辅助蛋白（Accessory protein）在苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）中广泛存在，并与杀虫晶体蛋白的高效表达和晶体形成密切相关。本项目针对一种新的Bt cry基因启动子cry8E启动子，研究了cry8E启动子中辅助蛋白基因orf1在cry8E表达中的作用和对Cry8E蛋白杀虫活性、生化特性的影响，并探索辅助蛋白基因orf1对cry8E基因表达的分子调控机制及其对Bt Cry蛋白晶体形成过程的作用。通过测定突变和缺失orf1基因情况下β-半乳糖苷酶的活性，表明orf1基因是在转录水平上抑制cry8E启动子的转录活性，通过将orf1基因重新导入缺失orf1基因的菌株中发现，其转录活性又可以恢复，说明orf1基因的存在会抑制cry8E基因的表达。同时发现在orf1基因互补序列中存在启动子活性，5′-RACE方法测定orf1基因互补序列启动子的转录起始位点，并且发现orf1基因互补序列启动子序列与SigK和SigW因子识别序列高度相似，转录活性分析发现orf1基因互补序列启动子在sigW突变体中丧失了β-半乳糖苷酶的活性，说明该启动子受SigW因子调控，综合上述结果表明orf1基因是在转录水平上借助SigW因子控制orf1基因互补序列中启动子抑制cry8E启动子的活性。明确了辅助蛋白ORF1对Cry8E蛋白的晶体形态、晶体大小以及杀虫活性没有显著性影响；辅助蛋白ORF1在苏云金芽胞杆菌母细胞区表达，呈聚集状态与杀虫晶体蛋白伴随存在，说明其在时间和空间上与杀虫晶体蛋白的形成密切相关。orf1基因缺失导致Bt细胞利用D-海藻糖和丁氨酸利用能力高，而鸟嘌呤和黄嘌呤利用率略有降低，说明orf1基因的缺失可以影响Bt细胞的一些代谢途径。本项目关于辅助蛋白ORF1在新型cry基因启动子中的生物学功能的研究结果，将为今后开展利用辅助蛋白基因提高苏云金芽胞杆菌发酵生产过程中Cry蛋白的产量和稳定性提供理论基础。

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