基于Transgelin-2靶标的针刺抗哮喘效应机制及活性小分子生物学功能研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
81574058
项目类别：
面上项目
资助金额：
59.0万
负责人：
杨永清
依托单位：
上海中医药大学
学科分类：
H3118.中医针灸学
结题年份：
2019
批准年份：
2015
项目状态：
已结题
起止时间：
2016-01-01 至2019-12-31

项目参与者：
李艳红；张广全；刘艳艳；王文倩；管楠；杨莎莎；韩晓杰；
关键词：
支气管哮喘肌动蛋白结合蛋白-2 气道平滑肌针刺

项目摘要

The project is based on our clinical effective acupuncture treatment for asthma and years of mechanism study. Our previous studies showed that metallothionein 2 (MT-2) is an important anti-asthma acupuncture regulatory factor with in vivo and in vitro anti-asthma effects. Further studies have found that the actin-binding protein 2 (transgelin-2) is the target for MT-2 on airway smooth muscle cells. Preliminary studies have demonstrated that as the target for MT-2, transgelin-2 played a key role for MT-2 in the regulation of airway smooth muscle. On the basis of these studies and with gene knockout mice, the project intends to study the in vivo, in vitro biological functions of transgelin-2, screen active small molecules targeting transgelin-2, and the corresponding biological effect of the agonist of transgelin-2. Our study can not only clarify the mechanism of anti-asthmatic effects of acupuncture and the related material basis, but also provide a new pipeline for target discovery and innovative drug development based on acupuncture research.

本项目建立在我们针刺治疗哮喘临床有效，并经多年针刺抗哮喘作用机制和效应物质基础研究有所发现的基础之上。我们前期研究表明，金属硫蛋白2(MT-2)是针刺抗哮喘的重要调控因子，具有体内外抗哮喘作用。进一步研究证明，肌动蛋白结合蛋白2(transgelin-2)是MT-2在气道平滑肌细胞膜上的作用靶标。预初研究表明，transgelin-2作为针刺抗哮喘调控因子MT-2在气道平滑肌的靶标，在调节气道平滑肌细胞收缩舒张功能中具有关键作用。本项目拟在上述研究工作基础上，结合基因敲除小鼠，深入研究针刺抗哮喘靶标transgelin-2的体内、体外生物学功能，筛选针对transgelin-2靶标的活性小分子，明确基于针刺抗哮喘靶标transgelin-2的活性小分子的体内外抗哮喘作用。以期阐明针刺抗哮喘的作用机制和效应物质基础，同时为基于针灸效应物质基础研究的靶标发现和创新药物发展提供一条可能的新途径。

结项摘要

本项目利用基因打靶技术构建了针刺抗哮喘靶标transgelin-2(TG2)敲除小鼠。体内研究发现基因敲除后小鼠哮喘模型气道阻力显著增加(P<0.05)，肺顺应性显著降低(P<0.05)，提示TG2和哮喘密切相关。比较基因敲除小鼠肺泡灌洗液白细胞五分类计数，发现嗜碱性粒细胞百分比显著升高(P＜0.05)，淋巴细胞百分比明显降低(P＜0.05)，提示TG2在哮喘肺部炎症中起关键作用。完成了TG2基因敲除小鼠气管平滑肌细胞制备和鉴定。检测TG2敲除后对气管平滑肌细胞收缩舒张影响，发现TG2具有明确的收缩舒张调控生物学效应。利用激光共聚焦显微镜明确TG2蛋白可表达在细胞膜、细胞质和细胞核。进一步筛选出21种具有抗ACh收缩效应的小分子，结果发现CAT12在纳摩尔剂量已能抵抗ACh收缩(EC50=2.9nM)。CAT12能显著降低大鼠离体气管螺旋条张力(P＜0.05)，且对乙酰胆碱酯酶活性无影响。利用WB检测发现CAT12通过影响Ezrin和RhoA-ROCK-MYPT1-MLC磷酸化实现气道平滑肌收缩舒张调控。通过结构优化获得CAT-M5111，M5115，M5116等三个小分子。利用表面等离子共振技术发现上述3个结构优化小分子与TG2有相互作用，KD值分别为2.394×10-5M，2.384×10-5M，8.474×10-6M。利用肺功能分析系统检测上述小分子对小鼠气道高反应性影响，发现吸入CAT-M5115、CAT-M5116后小鼠气道高反应性显著下降(P<0.05)。.本研究共发表学术论文16篇，其中SCI收录论文10篇；课题第一标注的代表性研究成果Transgelin-2 as a therapeutic target for asthmatic pulmonary resistance在2018年2月7日出版的国际期刊Science Translational Medicine上作为封面文章发表(IF=17.161)；获国家发明专利授权3项，实用新型授权1项；培养毕业博士研究生2人、硕士研究生5人。