小RNA工程调控技术的创建及其在蓝细菌辅酶A途径解析中的应用

As an important regulation strategy, small RNAs based post-transcriptional tools have been successfully developed in many microorganisms such as Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. However, so far no report of small RNA based regulatory tools suitable for photosynthetic cyanobacteria have been published, which has restricted the in-depth deciphering of the cyanobacterial biology and its biotechnological application. To address the issues, we propose to develop a small RNA based post-transcriptional regulatory tools for model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 and apply them to the investigation of essential coenzyme A biosynthetic pathway in cyanobacteria. The study is proposed based on two hypotheses: 1) the small RNA regulation tools applicable in other species such as E. coli might also be suitable for cyanobacteria; 2) post-transcriptional regulation by partial silencing or down-regulating essential genes or essential metabolic pathways would provide new technical methods for analysis of gene functions. The proposed research aims at: 1) using synthetic biology approach to establish two small RNA-based regulatory tools to achieve accurate regulation of target gene expression in Synechocystis sp. PCC 6803; 2) optimizing the small RNA based regulatory tools to conduct gene activation and silencing quantitatively; 3) applying the optimized small RNA regulatory tools to the elucidation of gene function of the essential metabolic pathway- coenzyme A synthesis in Synechocystis. The study will not only provide important molecular tools for studying key metabolic pathways and essential genes in Synechocystis sp. PCC 6803 and other cyanobacteria, but also improve our understanding of coenzyme A biosynthesis in cyanobacteria.

小RNA转录后调控工具对于研究必需基因有着重要意义。本申请针对模式光合蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803开发基于小RNA的转录后调控工具，并用于对蓝细菌必需代谢通路之一的辅酶A生物合成途径的解析。研究基于以下两个科学假设：一）适用于其他物种如大肠杆菌的小 RNA转录后调控策略可能同样适用于蓝细菌；二）通过转录后调控，部分沉默或下调必需基因或必需代谢通路可以为其功能解析提供新的技术方法。主要研究内容包括：一）运用合成生物学技术在Synechocystis中构建2套基于小RNA的调控工具并实现对靶基因表达的精准调控；二）对上述构建的小 RNA调控工具进行优化，实现对靶基因激活和沉默正反两个方向的定量调控；三）利用优化的小 RNA工具对Synechocystis中的必须代谢通路—辅酶A生物合成途径进行研究，解析其中关键基因的功能并实现对辅酶A生物合成的精确调控。

作为一种重要的转录后调控策略，基于小RNA的转录后调控工具在大肠杆菌和酿酒酵母等模式微生物中已得到成功应用，但目前还没有适用于光合蓝细菌的小 RNA调控工具的报道，这也一定程度上限制了对蓝细菌生命代谢研究及合成生物学应用的深入。 本申请针对模式光合蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803开发基于小RNA的转录后调控工具，并用于对蓝细菌必需代谢通路之一的辅酶A生物合成途径的解析。研究证实了以下两个科学假设：一） 适用于其他物种如大肠杆菌的小 RNA转录后调控策略同样适用于蓝细菌；二）通过转录后调控，部分沉默或下调必需基因或必需代谢通路可以为其功能解析提供新的技术方法。进行了如下主要研究内容并获得了相应结果：一）运用合成生物学技术在Synechocystis sp. PCC 6803中构建了2套基于小RNA的调控工具并实现了对靶基因表达的精准调控，具体包括基于人工PTRNA及Hfq-Micc两套调控工具，针对Synechocystis sp. PCC 6803内源基因glgc及外源基因lacZ等，均取得了较好调控效果，对目的基因的抑制率可达70%以上；二）对上述构建的小 RNA调控工具进行了优化，实现对靶基因激活和沉默正反两个方向的调控，通过不同强度的启动子及茶碱诱导型开关的使用，可实现对目的基因的可控调控，通过多小RNA的协同表达，最多可实现对4个基因的同时调控，随后这一调控工具又被拓展到聚球藻UTEX2973中，同样取得较好效果，通过配合正交使用的唾液酸诱导系统，可实现对外源基因的有效激活及先激活后抑制；三）利用优化的小 RNA工具对Synechocystis中的代谢通路辅酶A、糖原代谢、藻胆体代谢等的生物合成途径进行了调控及研究，解析了其中关键基因的功能，通过对糖原合成关键基因的调控实现了糖原合成的抑制，引导碳硫重新分配到外源产物甘油葡萄糖苷的合成中。研究结果为Synechocystis 及其他蓝细菌中关键代谢通路及必需基因的研究提供重要的分子工具，同时还将有助于加深对于蓝细菌中关键生物合成途径的机理和调控的解析。项目研究已发表SCI论文9篇。

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