微管去稳定蛋白MDP25调节植物气孔免疫的机制研究

Stomata are essential for gas exchange with the environment and the control of water loss. It has been commonly assumed that stomata are passive portals of entry for plant pathogenic bacteria. However, plants have evolved mechanisms to regulate stomatal aperture as an immune response against bacterial invasion. Stomatal closure occurs in response to bacterial pathogens and treatments with microbe-associated molecular patterns, and this is a part of the plant innate immune system. The microtubule cytoskeleton comprises a dynamic intracellular framework that responds rapidly to biotic stresses and supports numerous fundamental cellular processes. To date, however, little is known about the role of host-cell microtubule in stomatal closure during innate immunity. In this proposal, we aim to examine the microtubule dynamics in guard cell during stomatal closure upon pathogen and MAMP elicitation, and dissect the underlying mechanisms. The specific aims of this proposal include: 1. Investigating the timing and nature of microtubule rearrangement during MAMP-induced stomatal closure; 2. Identifying the upstream immune signaling impinging on microtubule cytoskeleton; 3. Dissecting the molecular mechanisms by which microtubule dynamics are regulated by a microtubule-destabilizing protein, MDP25, during MAMP-induced stomatal closure; 4. Examining the interaction between MDP25 and immune receptor BAK1. Successful completion of these goals will illuminate how microtubule operates and explain the function of microtubule arrays during stomatal movement in plant immunity. This will facilitate the creation of next-generation crops with the best combination of traits to satisfy the needs of disease resistance and crop yield.

气孔是病原菌入侵植物体的重要通道。但越来越多的研究表明气孔是先天免疫的重要环节。保卫细胞感知病菌和病菌保守分子MAMPs，从而关闭气孔限制病菌入侵。迄今为止，关于微管骨架在气孔免疫中的动态和生物学功能研究非常有限。我们发现拟南芥微管去稳定蛋白mdp25突变体的气孔免疫异常。本项目将以该突变体为切入点，探讨微管骨架在气孔免疫中的生理功能和分子调控机制。拟解决以下科学问题：1. 阐明植物气孔免疫过程中微管动态时空特性；2. 揭示免疫受体复合体是否参与调控气孔免疫中的微管动态；3. 阐述MDP25参与气孔免疫微管动态调节的分子机制；4. 探讨MDP25与上游免疫信号的互作机理及生理意义。本研究将为气孔免疫信号转导和调控机制提供分子和细胞学理论基础，拓展目前对植物气孔免疫的认知，同时为农业生产实践中作物细菌病害的防控提供理论基础和科学依据。

气孔是广泛分布在植物叶表面的微孔，是植物进行气体和水分交换的通道，为植物的生长发育所必需。同时，气孔也是病原菌进入叶间隙定殖的天然入口，但是植物可以通过关闭气孔来防御病原菌的入侵，这个过程被称为“气孔免疫”。前期研究显示微丝骨架和相关的细胞过程对于植物防御很重要。然而，人们对微丝骨架在植物防御中的确切功能仍然知之甚少。本项目对植物先天免疫过程中的气孔运动调节机制展开研究，探讨细胞骨架在气孔免疫中的生物学功能和潜在分子机制。基于磷酸化蛋白质组学分析表明多种细胞骨架蛋白在用flg22处理后迅速磷酸化，其中就包括来自拟南芥villin3 (VLN3)蛋白，该蛋白能切割微丝骨架。后续的研究进一步表明，VLN3是一个潜在的MAPK底物，表明了VLN3在植物先天免疫中的作用。本项目研究成果首先表明vln3突变体无法激活气孔免疫以防止细菌进入植物，导致植物对细菌感染的易感性增强。进一步研究表明，先天免疫过程中，VLN3被关键免疫激酶MPK3/6磷酸化。结合体内外磷酸化实验及质谱分析，结果表明VLN3第779位丝氨酸是其关键的磷酸化位点。为了研究MPK3/6磷酸化VLN3造成对VLN3生化功能的影响。本研究在体外采用荧光标记的微丝，结合全内反射显微镜，观察并统计分析了磷酸化修饰对VLN3蛋白切割功能的影响。实验结果表明，磷酸化修饰能有效促进VLN3蛋白切割微丝的功能。本工作进一步在植物体内研究表明VLN3和MPK3/6共同调控气孔免疫中的微丝排列。无论是从微丝整体动态还是从单根微丝的角度进行分析，VLN3和MPK3/6在气孔免疫微丝动态都具有调控作用。最后，本工作通过遗传学方法进一步在植物体内验证了MPK3/6对VLN3蛋白在779位丝氨酸的磷酸化修饰在气孔微丝动态调控及植物抗病上发挥关键作用。本工作结合生化、分子、遗传及细胞生物学等研究方法，揭示了在气孔免疫中微丝结合蛋白VLN3被MPK3/6磷酸化，直接快速的调节微丝骨架重塑以激活拟南芥中的气孔防御，该研究对揭示植物气孔免疫的机制提供了新见解。

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