类受体激酶SIT1与蛋白磷酸酶PP2AB’调节亚基κ1/2相互作用参与水稻盐胁迫反应的分子机制研究

Cell surface localized receptor like kinases (RLKs) are the major molecules perceiving external signal and initiating cellular signaling transduction. Dynamic activity of RLKs is critical for its function regulation. Our precious work demonstrated a lectin like –RLK SIT1 mediates the salt sensitivity in rice. Continuous activation of SIT1 leads to plants hypersensitive to salt stress and growth arrest. Mass spectrometric analysis of immuno-precipitated SIT1, we identified the κ1, one of the protein phosphatase 2A (PP2A) B’ regulatory subunits, of PP2A trimer-holoenzyme, mainly determine the substrate specificity. We therefore hypothesized that SIT1 might be de-phosphorylated by PP2A through binding with κ1. In this project, we will analyze whether κ1 and its homolog κ2 could mediate the dephosphorylation of SIT1 by PP2A; whether salt stress could trigger the activity of PP2A; whether SIT1 could regulate the activity of PP2A via phosphorylating κ1/2. Next, we will also determine the genetic interaction of SIT1 and κ1/κ2 under salt stress by analyzing of rice seedling in different background including, κ1 and κ2 knockout mutants, and their cross plants with SIT1 loss-of-function mutant sit1-1 and SIT1 overexpression lines respectively. Finally, we will provide the biochemical evidence to show that the interaction of SIT1 with κ1 and κ2 is involved in the regulation of the kinase activity of SIT1 and the κ1/2-mediated phosphatase activity of PP2A under salt stress condition. Taken together, we may reveal a novel mechanism for rice response to salt stress thought the SIT1 and PP2A interaction and regulation.

植物细胞表面的类受体激酶是介导外界信号向细胞内传递的重要分子，对它活性的调节是维持它正常功能的关键。已有证据表明受体激酶SIT1介导了水稻对盐胁迫的敏感性，它的持续活化则引发植物的敏盐反应和生长缺陷。我们在SIT1的蛋白复合体中鉴定到了蛋白磷酸酶PP2A的调节亚基κ1，意味着SIT1有可能被PP2A脱磷酸化下调其活性。本项目将重点分析盐如何影响PP2A的活性，κ1与同源蛋白κ2是否能介导PP2A对SIT1的脱磷酸化。相反SIT1是否能够磷酸化κ1和κ2实现对它们所参与的PP2A磷酸酶活性的调节。通过分析κ1和κ2缺失或过表达植株分别与SIT1缺失突变体或过表达植株的杂交株系的耐盐表型明确二者的遗传学关系。利用生物化学等手段分析这些杂交材料中SIT1激酶活性、κ1和κ2参与的PP2A酶活性、以及它们之间的互作在盐处理前后的变化，阐明SIT1与PP2A之间的双向调节对水稻应答盐胁迫的关键作用。

盐胁迫是导致农业减产的一个重要原因。为了增强对盐胁迫的耐受性，植物需要通过盐信号感知和信号转导网络对抗盐相关的功能基因进行调节。水稻SIT1（Salt Intolerance 1）是一个在盐胁迫早期被激活的类受体激酶，其活性在盐处理15分钟左右明显升高，随后伴随着衰减，SIT1过表达严重抑制水稻生长并导致盐胁迫敏感性增强（Plant cell, 2014），说明SIT1的活性应受到严格控制，因此参与SIT1活性调节的信号分子以及盐诱导SIT1的短期激活对水稻耐盐的生物学意义都值得进一步研究。为了解决这些问题，本项目首先利用定量蛋白组学方法鉴定了盐诱导SIT1活性升高的关键磷酸化位点Thr515/516，该位点位于激酶活化环，结合遗传和生化实验证明该位点的磷酸化对于SIT1的功能和活性都是必需的。之后我们利用IP-MS技术在SIT1蛋白复合体中鉴定到蛋白磷酸酶2A（PP2A）调节亚基B'κ，遗传与生理学实验表明B'κ正调节水稻耐盐性，并且B'κ过表达能够抑制SIT1的过表达所引起的水稻盐敏感性；生化实验结果表明B'κ-PP2A能使Thr515/516去磷酸化来抑制盐诱导的SIT1活性升高，说明B'κ-PP2A是控制SIT1的活性重要分子。另一重要发现是：盐胁迫能诱导B'κ的蛋白积累，并且该过程依赖于SIT1对B'κ C末端Ser502的磷酸化修饰。此调节机制在已知功能的植物PP2A中并不多见。综上我们认为：SIT1被盐胁迫激活，进而磷酸化B'κ，增加其稳定性，从而组装大量B'κ-PP2A来削弱过高的SIT1活性，因此两者相互调节介导了水稻从盐胁迫响应向适应的转换（Plant cell, 2019）。.为了寻找盐胁迫过程中受PP2A调节的其它蛋白，我们通过质谱鉴定了水稻和拟南芥PP2A蛋白复合体，从中也发现了一些与盐胁迫相关的蛋白，例如，拟南芥PP2A能去磷酸化ABA调节的转录因子AKSs（Molecular Plant, 2017）；水稻中的互作蛋白目前正在验证。.本项目执行过程中，项目组成员熟练利用定量蛋白组学、遗传学与生理生化相关实验手段对任务书中所列科学问题进行了探索，达到了预期目标，共发表2篇高水平SCI论文，申请人两次被应邀在国内学术会议做学术报告，指导2名博士生毕业，目前在读博士和硕士各1名继续完成项目后续工作。

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